Samenvatting gentechnologie (FBT)

Samenvatting gentechnologie


Inhoud:
H1: Enzymen uit de recombinant DNA technologie
H2: Vectoren voor kloneringen
H3: Moleculaire klonering
H4: Universele klonering
H5: Assemblages
H6: Recombinante expressie in prokaryoten
H7: Recombinante expressie in eukaryoten



H1: Enzymen uit de recombinant DNA technologie

 Endonucleasen en het CRISPR/Cas-systeem
 Exonucleasen
 Ligasen
 Fosfatasen en kinasen
 DNA polymerasen
 Revers transcriptase
 Terminaal deoxynucleotidyl transferase (TdT)
 Topoisomerasen
 Recombinasen



1.1 Endonucleasen en het CRISPR/Cas-systeem

Restrictie-endonucleasen = deel van restrictie-modificatie systeem van bacteriën
 dient voor restrictie vreemd DNA (bv. bacteriofaag-DNA) door degradatie
 bescherming eigen DNA door methylatie (methylasen)

Gekend voorbeeld: EcoRI
- Van E. coli
- Enzym herkent sequentie GAATTC
- Beide strengen gekliefd
- Knip = asymmetrisch: ontstaan twee fragmenten met 5’ overhang




Naamgeving:

EcoRI BamHI

,E = genus Escherichia B = genus bacillus
co = soort coli am = soort amylolique faciens
R = stam RY13 H = stam H
I = 1ste geisoleerde endonuclease I = 1ste geisoleerde endonuclease


Verschillende klassen:

Type I Type II Type III
Herkennen specifieke Herkennen specifieke Kenmerken van beide
sequenties sequenties types I en II

Knippen -1000 – 5000 Knippen beide strengen Knippen beide strengen
basen verder van DNA, dicht bij op een zekere afstand
herkenningssite (knippen van de
erin) herkenningsplaats

Knippen stuk (-75nt) Co-factor: Mg2+ Co-factoren: Mg2+ en ATP
eruit
Tweede molecule van het Nuclease en methylase
RE nodig om 2e streng te apart
knippen
Co-factoren: Mg2+, ATP Palindroom sequentie
en SAM (S-adenosyl
methionine)

Minimum 4 bp

Knippen
reproduceerbaar



DNA-fragmenten die geknipt werden met restrictie-enzymen, kunnen gebruikt
worden om chimere constructies te maken = combineren van DNA van
verschillende oorsprong (dankzij compatibele eindjes)
 Stukken worden covalent gebonden (fosfodiesterbinding) met behulp van DNA
ligase

,1.2 Endonuclease: Crispr/Cas9

 CRISPR = Cluster regularly interspaced short palindromic repeats
 Cluster: groepering van regelmatige plaatsjes ertussen
= nucleinezuursequentie
 Cas = CRISPR associated protein(s)
 knipt midden in sequentie (= endonuclease) op welbepaalde positive
aangeduid door CRISPR
 Gene-targeted modificatie
- Kan DNA aanpassen zoals die wil
- Genome editing met RNA als gids: RGEN = RNA-guided endonucleases
- Defecte genen vervangen of actieve genen uitschakelen
 In vitro en in vivo
 Verworven immuunsysteem bacteriën en Archaea



Werking:

1. Stuk target DNA herkend door complementair RNA

crRNA = CRISPR RNA = herkent complementair stuk van 20nt in target DNA
tracrRNA = trans-activating RNA = complementair met deel crRNA
 Vormen samen duplex  kan ook vervangen worden door 1 sgRNA = single
guide RNA (in systemen met streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9))

Protospacer = stuk van 20nt dat herkend wordt door het crRNA

NGG = protospacer adjacent motif (PAM) = motief van drie nucleotiden

Protospacer + PAM =sequentie = targetsite RNA-guided endonuclease
(RGEN), in dit voorbeeld Cas9

2. Cas-enzym knipt dsDNA in beide strengen




CRISPR/Cas9 in bacteriën en Archaea:

, Bacterie kan aangevallen worden door bacteriofaag en viraal DNA komt in
genoom bacterie  bacterie wordt immuun en bouwt CRISPR-locus in  na
volgende aanval bacteriofaag kan dat vreemd DNA aangevallen worden

 Bescherming tegen vreemd DNA
 Vreemd DNA wordt herkend en ingebouwd in genoom  wordt CRISPR-
locus
Vreemd DNA = ‘protospacer’
 Dit wordt later afgeschreven in pre-CRISPR RNA (complementair)
 Geprocessed tot crRNA
 Interactie tss crRNA en tracrRNA stuurt SpyCas naar DNA seq
complementair aan protospacer



Stappen verworven immuunsysteem in bacteriën:

1. Faag-DNA komt binnen in de bacteriële cel
2. CAS endonuclease klieft het faag-DNA in stukken
3. Deze stukken DNA-fragmenten worden nieuwe spacers die in de CRISPR-
locus worden ingebouwd
4. DNA uit de CRISPR-locus wordt afgeschreven in pre-CRISPR RNA
5. Pre-CRISPR RNA wordt geprocessed tot crRNA en vormt een hybride met
tracrRNA
6. tracrRNA trekt het CAS endonuclease aan
7. crRNA herkent het binnenkomende faag –DNA
8. Samen inactiveren ze het faag-DNA