Samenvatting Biotechnologie FBT

Samenvatting biotechnologie
Hoofdstuk 1: Basistools in DNA technologie..................................................................2
1.1 Isolatie van DNA en RNA uit cellen of weefsels....................................................2
1.2 Enzymen die inwerken op DNA of RNA.................................................................4
1.3 Elektroforese voor de analyse van DNA en RNA..................................................6
1.4 Blotten..................................................................................................................8
1.5 DNA- en cDNA-bibliotheken..................................................................................8
1.6 PCR en qPCR.........................................................................................................9
1.7 DNA sequentiebepaling......................................................................................12
Hoofdstuk 2: Moleculaire diagnostiek..........................................................................13
2.1 Moleculaire diagnostiek in de genetica..............................................................13
2.2 Moleculaire diagnostiek in de hematologie........................................................20
2.3 Moleculaire diagnostiek in de forensische analyse............................................22
Hoofdstuk 3: Kloneren van DNA sequenties................................................................25
3.1 De basisstappen in een kloneerstrategie...........................................................25
3. 2 Vectoren voor het dragen van DNA-sequenties................................................28
3.3 Gastheren voor de productie van recombinante eiwitten..................................33
3.4 Binnenbrengen van vectoren in gastheren........................................................37
Hoofdstuk 4: Recombinante eiwitten...........................................................................41
4.1 De structuur van eiwitten...................................................................................41
4.2 Opzuiveren van recombinante eiwitten..............................................................42
Hoofdstuk 5: Biofarmaca.............................................................................................43
5.1 Indeling van biofarmaca.....................................................................................43
5.2 Overzicht van bestaande biofarmaca.................................................................44
5.3 Productie van biofarmaca...................................................................................53




1

, Hoofdstuk 1: Basistools in DNA technologie
1.1 Isolatie van DNA en RNA uit cellen of weefsels
Isolatie van DNA

- Voorbereiding van het startmateriaal
 Cellen uit cultuur: scheiden van groeimedium via centrifugatie
 Weefselstalen: eerst homogeniseren om individuele cellen te verkrijgen
 Startmateriaal  vers of direct ingevroren om enzymatische degradatie
te vermijden
- Vrijmaken van DNA
 Openbreken van cellen en weefsels
 Mechanisch: homogeniseren,
sonicatie, bead mill, french press, …
 Lysis membraan
 Homogeniseren, koken +
vries-dooi cycli, proteïnase K
weefseldigest
 mbv. detergent SDS
 Plantencellen: celwand mechanisch
breken (bv. malen van
gevriesdroogd weefsel)
 DNA scheiden
 Supernatans  DNA  bruikbaar voor PCR, hybridisatie of
restrictiedigest
 Pellet  cel debris
- Opzuivering van DNA  Nodig wanneer remmende factoren aanwezig zijn in
extract
 Protease  afbraak eiwitten (DNase)
 RNase  afbraak RNA
 Detergenten (SDS)  afbraak lipiden
 Zouten  klonteren van debris, scheiding via centrifugatie
 Grampositieve bacteriën: peptidoglycaanlaag afbreken met lysozyme
- Verdere opzuivering
 denaturatie eiwitten  ureum of guanidine thiocyanaat:
 verminderen hydrofobe interacties en verbreken
H-bruggen
 precipitatie eiwitten, RNA en celdebris  geconcentreerde
zoutoplossing (NH4)2SO4
 afhankelijk van grootte en AZ-samenstelling
 Plantenextracten: verwijderen van polysacchariden, polyfenolen en
tannines
 CTAB, β-Me  reduceren S-S bruggen
 Polyvinylpyrrolidon (PVP) inhibeert polyfenolen
- Zuiveringsmethoden
 Fenol-chloroform extractie:
 eiwitten naar organische fase, DNA/RNA naar
waterige fase
 Alcoholprecipitatie:
 DNA neerslaan met ijskoude ethanol/isopropanol  pellet na
centrifugatie
 Kolomchromatografie:


2

, binding DNA aan matrix (anion-uitwisselaar/ silica); elutie ~ pH
en zout conc.
 Gelfiltratiechromatografie: scheiding op basis van molecuulgrootte



- Opslag en buffers
 Elutie in water of lichte alkalische buffer (Tris-HCl pH 8,5 of TE)
 EDTA:
 Inhibitie DNase (bindt Mg²⁺)  kan reacties zoals PCR hinderen
 Zouten  beterer oplosbaarheid van DNA
 Hinderen bij PCR/ sequencing
 Bewaring bij 4 °C, -20 °C of -80 °C; vermijden van vries-dooi cycli
- Kwaliteitscontrole
 Concentratie: meten van absorbantie bij 260 nm
 Wet van Lambert Beer: A=C.s.l
 sdsDNA=0,020 (μg/ml)/cm, l=1 cm  C=A260.50
 Zuiverheid:
 A260/A280 = 1,7–2,0 (eiwitcontrole)
 A260/A230 > 1,5 (controle op organische
contaminanten/zouten)
- Isolatie van plasmide DNA
 Selectieve alkalische denaturatie
 van chromosomaal DNA met hoog moleculair
gewicht
 neutralisatie en renaturatie
 Gesloten circulair DNA wordt dubbelstrengig
 centrifugatie
 supernatans: plasmide DNA
 pellet: genomisch DNA

Isolatie van RNA

- Algemene aandachtspunten
 RNA is zeer gevoelig voor afbraak door RNasen (stabiele enzymen, niet
volledig geïnactiveerd door autoclaveren)
 RNase-vrije omstandigheden creëren:
 Oplossingen behandelen met DEPC + autoclaveren
 DEPC reageert met katalytisch histidine in reactief
centrum RNase
 = inhibitie van enzymatische activiteit
 Glaswerk/metalen 2 uur bakken bij 180 °C
 Handschoenen dragen om contaminatie via huid te vermijden
- Isolatieproces  Analoge stappen als bij DNA:
 Weefsel homogeniseren + Cellyse met mild detergent (bv. NP40)
 Toevoegen van RNase inhibitoren (RNAsin, RNAlater, vanadyl-
ribonucleoside) bij vers dierlijk weefsel
 Guanidine isothiocyanaat  denatureert eiwitten (incl.
RNasen)
 Proteïnase K  afbraak ribonucleoproteïne-complexen
- Extractie en precipitatie
 Zure fenol-extractie:
 Eiwitten  fenolfase
 Denaturatie van eiwitten met guanidine thiocyanaat

3

,  DNA  interfase  op scheidingsvlak
 RNA  waterige fase
 RNA isolatie uit supernatans via ethanolprecipitatie
 Oplossen in RNase-vrij water + toevoeging van RNase inhibitore
- RNA-types en verrijking
 Gezuiverd RNA = >95 % rRNA + 5% mRNA
 Interesse meestal in mRNA (codeert voor eiwitten)
 Silica-kolommen: binden RNA ≥200 nucleotiden  verrijking voor mRNA
 5,8S rRNA, 5S rRNA en tRNA’s uitgesloten
 Affiniteitschromatografie:
 PolyA-staart van eukaryotisch mRNA bindt aan oligo(dT)-
cellulose of poly(U)-sepharose bij hoge zoutconcentratie
 Elutie door verlagen van zoutconcentratie
- Bewaring: bij -20 °C of -80 °C  vermijd vries-dooi cycli
- Kwaliteitscontrole
 Concentratie: meten bij 260 nm
 C=A260.40
 Zuiverheid:
 A260/A280 = 1,7-2,0 en A260/A230 > 1,5
 A280: eiwitten (aromatische aminozuren)
 A230: organische verbindingen en chaotrope zouten
 Integriteit:
 agarosegelelektroforese
 Intact RNA  duidelijke 18S en 28S rRNA banden/pieken
 Afgebroken RNA  diffuse smeer zonder scherpe banden
 Bioanalyzer
 scherpe ribosomale pieken: 18S < 28S=
intact RNA
 RIN (RNA integrity number)
 Kleine piekjes = afbraak



1.2 Enzymen die inwerken op DNA of RNA
- Nucleasen
 Hydrolyseren fosfodiësterbindingen  afbraak van nucleïnezuren
 Specificiteit: DNA-specifiek, RNA-specifiek of beide
 Voorkeur voor enkelstrengig of dubbelstrengig nucleïnezuur
 Exonucleasen: knippen vanaf 3’- of 5’-uiteinde  mononucleotiden
 Endonucleasen: knippen intern  laten hydroxyl- en fosfaatuiteinden
achter
 DNase I:
 Endonuclease  knipt DNA tot mono-/oligonucleotiden
 Toepassing: aantonen van DNA-bindende eiwitten die DNA
beschermen tegen afbraak (DNA bindende regio’s = footprint
regio’s)
 RNase A:
 enkelstrengig RNA, knipt bij C/U  3’-fosfaat uiteinde
 RNase H:
 knipt RNA in DNA/RNA-duplex  ssDNA  5'-fosfaat uiteinde
 RNase III:
 splitst ds 16S en 23S rRNA in operon (E.coli)
 splits pre-miRNA → matuur miRNA (H. sapiens)

4