Demo: Confirmatietechnieken
Positieve resultaten uit de screening moeten worden bevestigd in de stap ‘identificatie en
confirmatie’. In deze stap wordt niet enkel bevestigd wat de positieve resultaten uit de
screening waren, maar krijgen we ook een beter beeld van welke componenten exact
aanwezig zijn. Zo kunnen we bv. identificeren welke geneesmiddelen of drugs er exact
aanwezig waren wanneer we een positief testresultaat hadden voor een bepaalde klasse. Er
zijn verschillende technieken om positieve resultaten te confirmeren, hier focussen we op
gaschromatografie en vloeistofchromatografie.
1. Gaschromatografie (GC)
Intro
Bij gaschromatografie is het de bedoeling dat we vluchtige componenten uit een staal
scheiden. We werken steeds met een vaste stationaire fase en een gasvormige mobiele
fase. De componenten uit het staal moeten ook in de gasfase voorkomen, hoewel dit niet
voor alle componenten even makkelijk is: componenten met groot moleculair gewicht en
zeer polaire verbindingen kunnen moeilijk gescheiden worden met gaschromatografie. De
polaire componenten kunnen wel gederivatiseerd worden waardoor ze minder polair zijn.
Het principe van de scheiding bij gaschromatografie is gebaseerd op 2 belangrijke pijlers:
De affiniteit van de verschillende componenten voor de stationaire fase (dit is bij alle
vormen van chromatografie belangrijk)
De dampdruk van de verschillende componenten, de verbindingen moeten in de
gasfase zijn bij een temperatuur lager dan 400°C.
De basisopstelling van een gaschromatograaf bevat van links naar rechts:
Een gascilinder: deze voert de mobiele fase aan en kan bijvoorbeeld een gasfles zijn
aan het toestel of een leiding.
De gaschromatograaf met de injector waar de stalen op de kolom gebracht worden.
De injector bevindt zich in een oven want de injector en het staal moeten worden
opgewarmd voor de chromatografie. De stalen worden in vials gebracht en in de
autosampler geplaatst.
De kolom waar de scheiding van de componenten gebeurt
Detector die instaat voor de detectie van de verschillende componenten die van de
kolom komen. Er zijn verschillende detectoren mogelijk. Hier zien we de
massaspectrometer met quadrupolen.
Een output waar we de chromatogrammen en data kunnen verzamelen en zien, dit is
vaak een computer.
1
,Staalintroductie
Bij GC wordt een gasvormig of vloeibaar staal geïntroduceerd op de kolom met de injector.
Gasvormige stalen kunnen als gas (Headspace GC) of als vloeistof geïnjecteerd worden,
waarbij het vloeibare staal in de gasfase gebracht wordt op de kolom of voor het op de
kolom komt. Voor de meeste stalen is er grondige staalvoorbereiding nodig aangezien de
stalen vaak complex zijn (bloed of urine) en we willen vermijden dat er matrix op de kolom
komt. Staalvoorbereiding kan gebeuren met LLE of SPE. Er wordt steeds gewerkt met kleine
volumes, de detector en injector moeten dus gevoelig zijn.
De injector van de gaschromatograaf is opgebouwd uit 3 zaken:
1. De injectienaald die het staal uit de vial zal opzuigen en op de kolom zal brengen
2. Het septum, een soort rubber dat het systeem afsluit en ervoor zorgt dat er geen
staal kan ontsnappen
3. De liner, een verdampingskamer onder de vorm van een glazen buisje waarin staal
kan verdampen.
Afhankelijk van het staal en de analyten kunnen we kiezen voor een vaporisatie-injector of
een cool-on-column-injector. Bij de vaporisatie-injector is er een liner aanwezig die toelaat
dat het vloeibaar staal kan verdampen voor het op de kolom komt. Bij de andere injector is
er geen liner waardoor het staal dus niet kan verdampen voor het de kolom bereikt en de
verdamping dus op de kolom gebeurt.
Vaporisatie-injectoren
Bij de vaporisatie-injectoren verdampt het staal voor de kolom in de liner. De buitenkant
van de injector bestaat uit metaal en wordt opgewarmd, binnenin bevindt zich de liner. De
injectienaald brengt het staal doorheen het septum tot in de liner, waar het staal
opgewarmd wordt door het metalen blok. De mobiele fase zal het staal doorheen de
vaporisatie-injector sturen tot aan de kolom. Er is een septum purge outlet: er wordt gas
naar buiten gebracht, de bedoeling is om componenten uit het septum die eventueel
kunnen vrijkomen door het verwarmen uit het systeem te halen zodat deze niet op de
kolom komen en zo geen vervuiling kunnen veroorzaken. Er is ook nog een split outlet, een
outlet die open of toe kan gezet worden naargelang de instellingen van het toestel en die
een deel van de mobiele fase en dus ook een deel van de analieten zal afvoeren.
2
, Split
Wanneer we de vaporisatie-injector gebruiken in split staat de split outlet open en kunnen
we regelen hoeveel deze doorlaat. Gebruik in split heeft het voordeel dat er geen
kolomoverbelading zal plaatsvinden. Een groot deel van de totale hoeveelheid analiet wordt
afgevoerd via de split outlet waardoor slechts een klein deel op de kolom komt.
Kolomoverbelading betekent dat er te veel analiet op de kolom aanwezig is waardoor de
piekvorm er niet meer goed uitziet. Het nadeel aan split is dat er een hoge concentratie aan
analiet nodig is en dat er een gevaar is voor degradatie van thermolabiele componenten
aangezien de injector verwarmd wordt, wat ervoor zorgt dat de bepaling niet meer kan
gebeuren of niet meer betrouwbaar is. Een laatste nadeel van de split is dat er discriminatie
is van hoogkokende componenten.
Hierboven zien we een voorbeeld van een situatie waar de split outlet open staat. Er gaat
33 mL/min in de kolom, waarvan 3 mL/min verloren gaat via de purge flow, die dient om
componenten van het septum weg te filteren. Van de overblijvende 30 mL/min wordt 29
mL/min via de split outlet naar buiten afgevoerd. De overblijvende flow gaat naar de kolom,
dit is 1 mL/min. De split ratio is 33/1, van de 33 mL die per minuut wordt ingevoerd wordt
slechts 1 mL naar de kolom gebracht.
Splitless
De splitless-manier vereist de sluiting van de split outlet. Er is geen afvoer van de analiet
waardoor lagere concentraties kunnen gemeten worden. Opnieuw zijn de nadelen hier dat
thermolabiele componenten niet (betrouwbaar) gemeten kunnen worden en dat er gevaar
is voor discriminatie van hoogkokende verbindingen.
3
Positieve resultaten uit de screening moeten worden bevestigd in de stap ‘identificatie en
confirmatie’. In deze stap wordt niet enkel bevestigd wat de positieve resultaten uit de
screening waren, maar krijgen we ook een beter beeld van welke componenten exact
aanwezig zijn. Zo kunnen we bv. identificeren welke geneesmiddelen of drugs er exact
aanwezig waren wanneer we een positief testresultaat hadden voor een bepaalde klasse. Er
zijn verschillende technieken om positieve resultaten te confirmeren, hier focussen we op
gaschromatografie en vloeistofchromatografie.
1. Gaschromatografie (GC)
Intro
Bij gaschromatografie is het de bedoeling dat we vluchtige componenten uit een staal
scheiden. We werken steeds met een vaste stationaire fase en een gasvormige mobiele
fase. De componenten uit het staal moeten ook in de gasfase voorkomen, hoewel dit niet
voor alle componenten even makkelijk is: componenten met groot moleculair gewicht en
zeer polaire verbindingen kunnen moeilijk gescheiden worden met gaschromatografie. De
polaire componenten kunnen wel gederivatiseerd worden waardoor ze minder polair zijn.
Het principe van de scheiding bij gaschromatografie is gebaseerd op 2 belangrijke pijlers:
De affiniteit van de verschillende componenten voor de stationaire fase (dit is bij alle
vormen van chromatografie belangrijk)
De dampdruk van de verschillende componenten, de verbindingen moeten in de
gasfase zijn bij een temperatuur lager dan 400°C.
De basisopstelling van een gaschromatograaf bevat van links naar rechts:
Een gascilinder: deze voert de mobiele fase aan en kan bijvoorbeeld een gasfles zijn
aan het toestel of een leiding.
De gaschromatograaf met de injector waar de stalen op de kolom gebracht worden.
De injector bevindt zich in een oven want de injector en het staal moeten worden
opgewarmd voor de chromatografie. De stalen worden in vials gebracht en in de
autosampler geplaatst.
De kolom waar de scheiding van de componenten gebeurt
Detector die instaat voor de detectie van de verschillende componenten die van de
kolom komen. Er zijn verschillende detectoren mogelijk. Hier zien we de
massaspectrometer met quadrupolen.
Een output waar we de chromatogrammen en data kunnen verzamelen en zien, dit is
vaak een computer.
1
,Staalintroductie
Bij GC wordt een gasvormig of vloeibaar staal geïntroduceerd op de kolom met de injector.
Gasvormige stalen kunnen als gas (Headspace GC) of als vloeistof geïnjecteerd worden,
waarbij het vloeibare staal in de gasfase gebracht wordt op de kolom of voor het op de
kolom komt. Voor de meeste stalen is er grondige staalvoorbereiding nodig aangezien de
stalen vaak complex zijn (bloed of urine) en we willen vermijden dat er matrix op de kolom
komt. Staalvoorbereiding kan gebeuren met LLE of SPE. Er wordt steeds gewerkt met kleine
volumes, de detector en injector moeten dus gevoelig zijn.
De injector van de gaschromatograaf is opgebouwd uit 3 zaken:
1. De injectienaald die het staal uit de vial zal opzuigen en op de kolom zal brengen
2. Het septum, een soort rubber dat het systeem afsluit en ervoor zorgt dat er geen
staal kan ontsnappen
3. De liner, een verdampingskamer onder de vorm van een glazen buisje waarin staal
kan verdampen.
Afhankelijk van het staal en de analyten kunnen we kiezen voor een vaporisatie-injector of
een cool-on-column-injector. Bij de vaporisatie-injector is er een liner aanwezig die toelaat
dat het vloeibaar staal kan verdampen voor het op de kolom komt. Bij de andere injector is
er geen liner waardoor het staal dus niet kan verdampen voor het de kolom bereikt en de
verdamping dus op de kolom gebeurt.
Vaporisatie-injectoren
Bij de vaporisatie-injectoren verdampt het staal voor de kolom in de liner. De buitenkant
van de injector bestaat uit metaal en wordt opgewarmd, binnenin bevindt zich de liner. De
injectienaald brengt het staal doorheen het septum tot in de liner, waar het staal
opgewarmd wordt door het metalen blok. De mobiele fase zal het staal doorheen de
vaporisatie-injector sturen tot aan de kolom. Er is een septum purge outlet: er wordt gas
naar buiten gebracht, de bedoeling is om componenten uit het septum die eventueel
kunnen vrijkomen door het verwarmen uit het systeem te halen zodat deze niet op de
kolom komen en zo geen vervuiling kunnen veroorzaken. Er is ook nog een split outlet, een
outlet die open of toe kan gezet worden naargelang de instellingen van het toestel en die
een deel van de mobiele fase en dus ook een deel van de analieten zal afvoeren.
2
, Split
Wanneer we de vaporisatie-injector gebruiken in split staat de split outlet open en kunnen
we regelen hoeveel deze doorlaat. Gebruik in split heeft het voordeel dat er geen
kolomoverbelading zal plaatsvinden. Een groot deel van de totale hoeveelheid analiet wordt
afgevoerd via de split outlet waardoor slechts een klein deel op de kolom komt.
Kolomoverbelading betekent dat er te veel analiet op de kolom aanwezig is waardoor de
piekvorm er niet meer goed uitziet. Het nadeel aan split is dat er een hoge concentratie aan
analiet nodig is en dat er een gevaar is voor degradatie van thermolabiele componenten
aangezien de injector verwarmd wordt, wat ervoor zorgt dat de bepaling niet meer kan
gebeuren of niet meer betrouwbaar is. Een laatste nadeel van de split is dat er discriminatie
is van hoogkokende componenten.
Hierboven zien we een voorbeeld van een situatie waar de split outlet open staat. Er gaat
33 mL/min in de kolom, waarvan 3 mL/min verloren gaat via de purge flow, die dient om
componenten van het septum weg te filteren. Van de overblijvende 30 mL/min wordt 29
mL/min via de split outlet naar buiten afgevoerd. De overblijvende flow gaat naar de kolom,
dit is 1 mL/min. De split ratio is 33/1, van de 33 mL die per minuut wordt ingevoerd wordt
slechts 1 mL naar de kolom gebracht.
Splitless
De splitless-manier vereist de sluiting van de split outlet. Er is geen afvoer van de analiet
waardoor lagere concentraties kunnen gemeten worden. Opnieuw zijn de nadelen hier dat
thermolabiele componenten niet (betrouwbaar) gemeten kunnen worden en dat er gevaar
is voor discriminatie van hoogkokende verbindingen.
3
