Demo: Celculturen en toxiciteitstesten
1. Celculturen
Hier zien we hoe we omgaan met culturen in de praktijk.
Celcultuur
Vroeger sprak men over weefselkweek, een algemene term om alle soort weefsels in
cultuur te brengen. Na bepaalde tijd had men complexere technieken waardoor men
specifieke celculturen kon verkrijgen. Celculturen zijn afgeleid van primaire
weefselexplanten of celsuspensies. Er zijn twee types celculturen:
Primaire celcultuur: cellen die het uit lichaam genomen worden en in cultuur
gebracht worden bv huidcellen afnemen en in cultuur brengen. Het nadeel is dat de
cellen een beperkte levensduur hebben van 3 tot 4 weken. Er wordt hierdoor meer
gebruik gemaakt van stabiele cellijnen.
Stabiele cellijnen hebben een onbeperkte levensduur en zijn zo gemuteerd dat ze
oneindig kunnen delen. Ze zijn van tumorale oorsprong, bv. de Hela-cellen, afkomstig
van een patiënt in de jaren 50, die vandaag nog altijd in cultuur gehouden worden. Er
zijn ook andere manieren om stabiele cellijnen te bekomen, zoals het zeer lang
incuberen van primaire celculturen en hopen dat deze culturen mutaties doorlopen
waardoor de geïmmortaliseerd worden. Dit is veel omslachtiger, dus men werkt vaker
met tumorale cellen.
Cultuurcondities en werkapparatuur
Steriele werkplaats
In praktijk werken we in verticale laminaire flow: de lucht wordt vanboven aangezogen en
doorheen een HEPA (High Efficiency Particulate Air)-filter gestuurd en komt door de roosters
onderaan. Hierdoor wordt een steriele zone gecreëerd in de kast die zowel de cellen als de
persoon beschermt, aangezien de lucht niet in het gezicht wordt geblazen. De lucht
circuleert continu en bevat geen deeltjes groter dan 0,3 µm.
Een ander voorbeeld is een horizontale flow: de lucht wordt horizontaal doorheen de filters
geduwd en creëert een steriele zone in de kast. In dit geval wordt de gebruiker niet
beschermd. Dit is geen probleem wanneer men oogdruppels maakt, maar wel wanneer er
gewerkt wordt met kankercellen.
1
, Het is belangrijk om in een steriele zone te werken omdat er groot risico is op bacteriële
groei. De menselijke (kanker)cellen hebben een verdubbelingstijd van ongeveer 24-48 uur.
Bacteriële cellen hebben een verdubbelingstijd van enkele uren of minuten. Het is dus
belangrijk dat er geen bacteriën aanwezig zijn in de lucht, aangezien deze de celcultuur
zouden kunnen overnemen.
Cultuurmedia
Naast een steriele omgeving zijn er ook celcultuurmedia nodig om de cellen te doen
groeien. DMEM (Dulbecco’s Minimum Essential Medium) is het meest gebruikte medium en
bevat isotone zouten (carbonaatbuffer), suikers, vitamines en aminozuren. Dit noemen we
het chemisch gedefinieerde deel van het medium, er is exact geweten hoeveel van elke
component aanwezig is. Er is buiten deze componenten ook nog een natuurlijk product
nodig om de cellen te doen groeien, namelijk serum. Dit is chemisch niet gedefinieerd
aangezien serum heel erg kan variëren in samenstelling tussen verschillende batches.
Cellen groeien in de incubator bij 5% CO 2 en 37°C. Het gehalte aan CO2 zorgt samen met de
carbonaatbuffer voor een optimale pH van 7,4.
Om te zien of de pH al dan niet correct is, is er een pH-indicator toegevoegd (zoals
fenolrood). In de optimale situatie is de indicator rood, wat betekent dat de pH neutraal is.
De indicator kan omslaan naar paars of geel. Indien het medium paars is, is het medium
alkalisch en zullen de cellen zijn geïncubeerd in een omgeving die te weinig CO 2 heeft om
de pH te kunnen bufferen. Als de cultuur geel wordt, kan dit wijzen op het feit dat de
cultuur al van een bepaalde leeftijd is. De afvalstoffen die gevormd worden, zijn zuur,
waardoor het medium verzuurt en bijgevolg geel wordt.
Naast de vaste componenten (zouten e.d.) moeten we het serum toevoegen. Dit is de
heldere fase die we terugvinden na stolling van het bloed. Het serum varieert qua
samenstelling en bevat alle hormonen en groeifactoren om de cellen te doen groeien. De
cellen groeien beter door de aanwezigheid van het serum, maar worden er ook door
beschermd: serum bevat albumine dat allerlei toxische producten en proteasen
neutraliseert. In sommige gevallen kan er tijdelijk in een serumvrij medium gewerkt
worden:
Wanneer men het effect van bepaalde stoffen wilt nagaan zonder proteïnebinding,
zoals bij veel toxiciteitstesten. Het albumine in het serum bindt veel verschillende
stoffen en kan dus de toxiciteit maskeren.
Wanneer we geïnteresseerd zijn in het oogsten van een bepaald product dat de
cellen produceren, is de opzuivering veel makkelijker in serumvrij medium dan in
een medium met serum. Het serumvrije medium is eigenlijk gewoon water met wat
zouten en suikers, waardoor de eiwitten makkelijker te isoleren zijn dan tussen de
andere eiwitten in serum.
Groeisubstraten
Cellen kan je hebben in suspensie (suspensiecellen) of als adherente cellen, die een
oppervlakte nodig hebben om te kunnen groeien. Als er geen oppervlakte is waaraan deze
cellen kunnen vasthechten, kunnen ze geen groeifactoren produceren en zullen ze bijgevolg
afsterven.
2
1. Celculturen
Hier zien we hoe we omgaan met culturen in de praktijk.
Celcultuur
Vroeger sprak men over weefselkweek, een algemene term om alle soort weefsels in
cultuur te brengen. Na bepaalde tijd had men complexere technieken waardoor men
specifieke celculturen kon verkrijgen. Celculturen zijn afgeleid van primaire
weefselexplanten of celsuspensies. Er zijn twee types celculturen:
Primaire celcultuur: cellen die het uit lichaam genomen worden en in cultuur
gebracht worden bv huidcellen afnemen en in cultuur brengen. Het nadeel is dat de
cellen een beperkte levensduur hebben van 3 tot 4 weken. Er wordt hierdoor meer
gebruik gemaakt van stabiele cellijnen.
Stabiele cellijnen hebben een onbeperkte levensduur en zijn zo gemuteerd dat ze
oneindig kunnen delen. Ze zijn van tumorale oorsprong, bv. de Hela-cellen, afkomstig
van een patiënt in de jaren 50, die vandaag nog altijd in cultuur gehouden worden. Er
zijn ook andere manieren om stabiele cellijnen te bekomen, zoals het zeer lang
incuberen van primaire celculturen en hopen dat deze culturen mutaties doorlopen
waardoor de geïmmortaliseerd worden. Dit is veel omslachtiger, dus men werkt vaker
met tumorale cellen.
Cultuurcondities en werkapparatuur
Steriele werkplaats
In praktijk werken we in verticale laminaire flow: de lucht wordt vanboven aangezogen en
doorheen een HEPA (High Efficiency Particulate Air)-filter gestuurd en komt door de roosters
onderaan. Hierdoor wordt een steriele zone gecreëerd in de kast die zowel de cellen als de
persoon beschermt, aangezien de lucht niet in het gezicht wordt geblazen. De lucht
circuleert continu en bevat geen deeltjes groter dan 0,3 µm.
Een ander voorbeeld is een horizontale flow: de lucht wordt horizontaal doorheen de filters
geduwd en creëert een steriele zone in de kast. In dit geval wordt de gebruiker niet
beschermd. Dit is geen probleem wanneer men oogdruppels maakt, maar wel wanneer er
gewerkt wordt met kankercellen.
1
, Het is belangrijk om in een steriele zone te werken omdat er groot risico is op bacteriële
groei. De menselijke (kanker)cellen hebben een verdubbelingstijd van ongeveer 24-48 uur.
Bacteriële cellen hebben een verdubbelingstijd van enkele uren of minuten. Het is dus
belangrijk dat er geen bacteriën aanwezig zijn in de lucht, aangezien deze de celcultuur
zouden kunnen overnemen.
Cultuurmedia
Naast een steriele omgeving zijn er ook celcultuurmedia nodig om de cellen te doen
groeien. DMEM (Dulbecco’s Minimum Essential Medium) is het meest gebruikte medium en
bevat isotone zouten (carbonaatbuffer), suikers, vitamines en aminozuren. Dit noemen we
het chemisch gedefinieerde deel van het medium, er is exact geweten hoeveel van elke
component aanwezig is. Er is buiten deze componenten ook nog een natuurlijk product
nodig om de cellen te doen groeien, namelijk serum. Dit is chemisch niet gedefinieerd
aangezien serum heel erg kan variëren in samenstelling tussen verschillende batches.
Cellen groeien in de incubator bij 5% CO 2 en 37°C. Het gehalte aan CO2 zorgt samen met de
carbonaatbuffer voor een optimale pH van 7,4.
Om te zien of de pH al dan niet correct is, is er een pH-indicator toegevoegd (zoals
fenolrood). In de optimale situatie is de indicator rood, wat betekent dat de pH neutraal is.
De indicator kan omslaan naar paars of geel. Indien het medium paars is, is het medium
alkalisch en zullen de cellen zijn geïncubeerd in een omgeving die te weinig CO 2 heeft om
de pH te kunnen bufferen. Als de cultuur geel wordt, kan dit wijzen op het feit dat de
cultuur al van een bepaalde leeftijd is. De afvalstoffen die gevormd worden, zijn zuur,
waardoor het medium verzuurt en bijgevolg geel wordt.
Naast de vaste componenten (zouten e.d.) moeten we het serum toevoegen. Dit is de
heldere fase die we terugvinden na stolling van het bloed. Het serum varieert qua
samenstelling en bevat alle hormonen en groeifactoren om de cellen te doen groeien. De
cellen groeien beter door de aanwezigheid van het serum, maar worden er ook door
beschermd: serum bevat albumine dat allerlei toxische producten en proteasen
neutraliseert. In sommige gevallen kan er tijdelijk in een serumvrij medium gewerkt
worden:
Wanneer men het effect van bepaalde stoffen wilt nagaan zonder proteïnebinding,
zoals bij veel toxiciteitstesten. Het albumine in het serum bindt veel verschillende
stoffen en kan dus de toxiciteit maskeren.
Wanneer we geïnteresseerd zijn in het oogsten van een bepaald product dat de
cellen produceren, is de opzuivering veel makkelijker in serumvrij medium dan in
een medium met serum. Het serumvrije medium is eigenlijk gewoon water met wat
zouten en suikers, waardoor de eiwitten makkelijker te isoleren zijn dan tussen de
andere eiwitten in serum.
Groeisubstraten
Cellen kan je hebben in suspensie (suspensiecellen) of als adherente cellen, die een
oppervlakte nodig hebben om te kunnen groeien. Als er geen oppervlakte is waaraan deze
cellen kunnen vasthechten, kunnen ze geen groeifactoren produceren en zullen ze bijgevolg
afsterven.
2
