samenvatting - gentechnologie - UCLL(biochemie)

Gentechnologie
H1: Next Generation Sequencing (NGS)
1.1 Inleiding
Sanger sequencing: methode om volgorde DNA-basen te bepalen
 Gebaseerd op de incorporatie van keten-terminerende dideoxynucleotiden
 Kan fragmenten van 800 bp sequencen
 Om na te gaan of DNA-fragment correct is gekloneerd in vector
 Tot 99% van het humaan genoom in kaart gebracht
 Nood aan meer geavanceerde technologie nodig
NGS: miljoenen DNA moleculen sequenceren  bioinformatica
1.2 Sequencing by synthesis: Illumina
Illuma: marktleider op vlak van NGS-instrumenten
 Gelijkaardig aan Sanger-sequencing
 miljoenen templatemoleculen aan vaste dragers
1.2.1 Staal voorbereiden: sample preparation
 Illumina kan maar 150 bp sequencen
 Genomische DNA-stalen eerst fragmenteren m.b.v. sonicatie
o Geluidsgolven met ultrahoge frequentie
o Breuken introduceren in het DNA
o Levert zowel sticky-ends als blunt ends
o Stickey ends worden door end repair blunt gemaakt
o Aan 3’-blund end wordt 1 A gehangen
o 5’-T adapter ligatie aan deze A
o PCR amplificatie tot ds DNA-fragmenten

1.2.2 Clustervorming
 Denaturatie ds DNA-stalen door NaOH
 Laden op flowcell: weide van ss probes
o Sequentie complementair aan sequentie van de adapters
o Ss DNA-stalen hybridiseren met ss probes
o Bridge amplification: 1 enkele DNA-streng 1000 x geamplificeerd

 cluster van identieke strengen DNA
1.2.3 Sequencing by synthesis
 start vanaf sequencingprimer die
complementair is aan één v/d adapters
 bij elke cyclus een mengsel van de 4
dNTP’s toegevoegd

o dNTP’s bevatten een terminator
o Gaat ketenverlenging tegen

, o Slechts 1 base per cyclus ingebouwd
o Terminator bevat fluorescent label
 Na wegspoelen ongebonden dNTP’s foto maken van flowcell
o Cluster geeft kleur op basis van ingebouwde dNTP
o Verschillende golflengte per base
 Terminators en fluorescente signalen worden verwijderd voor volgende
cyclus
 Herhaald tot 150 bp  basevolgorde bepaald voor de cluster
 Met bio-informatica deze stukjes DNA in correct volgorde plaatsen
 Volledige genoomsequentie teststaal bepaald




1.3 Single molecule real time sequencing (SMRT): PacBio
Veel grotere DNA-fragmenten: gemiddeld 10 000 bp
1.3.1 Staal voorbereiden: constructie van SMRTbell-templaten
 DNA wordt gefragmenteerd
 Sticky ends worden blunt gemaakt en 1 A aan gehangen
 Ligatie van lus-vormige adapters
 Gecirculariseerde templaten
1.3.2 Single molecule sequencing
 Circulaire templaten binden SMRTcell: bevat duizenden zero-mode
waveguides (ZMW’s)
o ZMW nanostructuren zijn putjes in een aluminiumlaag
o 1 DNA-polymerase gefixeerd op bodem
 MagBeads waarop templaten gebonden zijn rollen over de SMRT-cell
 Enkel minimale templaten zullen op de bodem v/e ZMW geraken
 DNA-polymerase houdt het templaat vast
o Inbouw van 1 nt kan gemeten worden
o Elk v/d 4 nt is gelabeld aan fosfaatuiteinde met verschillende kleur
o Wanneer DNA-polymerase nt ingebouwd wordt fluorescent label
afgeknipt
 Detector detecteert signaal wanneer de base wordt ingebouwd = real
time

,1.4 Nanopore sequencing: Oxford Nanopore Technologies
Nanoporie: kleine opening van 1 nanometer in diameter.
 Gemaakt uit eiwitten of synthetische materialen (zoals grafeen).
1.4.1 Natuurlijke eiwit-nanoporiën:
 Gevonden in celmembranen, transporteren ionen of moleculen.
 Voorbeelden:
o α-hemolysine: heptameer proteïne (7 subeenheden), opening van 1
nm, doorlaat 1 molecule per keer (zoals DNA).
o MspA en CsgG: andere eiwit-nanoporiën die worden onderzocht.

1.4.2 Synthetische nanoporiën:
 Gemaakt door een gaatje te schieten in een synthetisch membraan met
een ionen- of elektronenstraal.
1.4.3 Werkingsprincipe van nanopore sequencing:
 Ionenstroom loopt door de porie door een
aangebrachte spanning.
 Elk nucleotide (A, C, G, T) blokkeert de porie op
een karakteristieke manier.
 Verandering in stroom geeft direct de DNA-
sequentie weer.
 Geen gemodificeerde nt nodig (verschil met
Illumina en PacBio sequencing).
1.4.4 Problemen en oplossingen:
 Probleem: DNA migreert te snel door de porie, wat zwakke signalen
oplevert.
 Oplossing: Enzymen zoals Phi29 DNA-polymerase worden gebruikt om het
DNA-transport te vertragen.
1.4.5 DNA-staal voorbereiden
1D sequencing: Sequencen van één streng van ds DNA
 10-min protocol:
 DNA-fragmentatie:
o Fragmentatie van DNA met een transposase.
o Transposase voegt adaptersequenties toe aan de uiteinden van de
DNA-fragmenten.
 Toevoegen van Y-vormige adapter:
o aan de DNA-fragmenten
o Enzymemotor zit aan één arm v/d adapter en duwt het DNA door de
porie.
o De andere arm bevat een verankeringsmolecule (tether) die het
DNA naar het membraan trekt.

, 2D sequencing: Sequencen van beide strengen.
 ligatie-gebaseerd protocol:
 DNA-fragmentatie:
o Fragmentatie van DNA tot de gewenste lengte (bv. door sonicatie).
 Fragmentuitbreiding:
o Uiteinden v/d fragmenten worden getrimd.
o Aan het 3’-uiteinde van het fragment wordt één enkele A gehangen.
 Ligatie van adapters:
o Eén adapter bevat de enzymemotor om het DNA door de porie te
duwen.
o andere adapter vormt lus die beide strengen koppelt.
 Verankeringsmoleculen:
o Verankeringsmoleculen worden toegevoegd via hybridisatie om het
DNA te binden aan het membraan.
o Resultaat 2D sequencing: Door de lus worden beide strengen van
het DNA gesequenced.
1.5 Ion Torrent semiconductor sequencing
1.5.1 Algemeen principe:
 Gebaseerd op de vrijzetting van H+ ionen tijdens DNA-polymerisatie
 Bij elke dNTP-incorporatie in de groeiende DNA-streng komt een H + vrij: pH-
verandering
 verandering wordt door ion-sensor gedetecteerd
1.5.2 Sample preparation:
 DNA-fragmentatie tot stukken van ongeveer 200 bp.
 Adapterligatie: uiteinden worden blunt gemaakt en via A-T-ligatie worden
specifieke adapters toegevoegd
1.5.3 Emulsie-PCR:
 Klonale amplificatie: Elk DNA-fragment wordt klonaal geamplificeerd
 Procedure:
o DNA-fragmenten worden gemengd met beads met ss probes,
complementair aan de adapters
o beads worden in water-olie-emulsie gebracht, elke druppel vormt
een microreactor voor PCR
o DNA hybridiseert aan bead meerdere PCR-cycli volgen om beads
volledig te bedekken met geamplificeerde moleculen
1.5.4 Sequencing by synthesis:
 beads worden over ion conductor chip gevloeid, waarbij elke microwell op
de chip 1 bead bevat
 Detectie van H+-ionen:
o pH-verandering wordt gemeten door ion-sensor onder elke well, die
dit omzet in een spanningsverandering