samenvatting - moleculaire biologie en biotechnologie 1 - UCLL(biochemie)

Moleculaire biologie en biotechnologie
H1: DNA drager v/h erfelijk materiaal
 Samenstelling nucleïnezuren
o Lineaire polymeren van nucleotiden
o Pentosesuiker: 2 typen
 RNA: β-D-ribose
 DNA: 2’-deoxy-β-D-ribose
 ‘ om C’s op suiker te
nummeren



o Basen
 Pyrimidines: 6-ring met 2 N-atomen
֍ Thymine (DNA)
֍ Uracil (RNA)
֍ Cytosine
 Purines: pyrimidine met
imidazoolring
֍ Adenine
֍ Guanine



o Nucleosiden
 formatie waarbij een purine of pyrimidine base met een suiker gebonden is
via β-glycosidische binding op 1’
 intermediaire van biologische afbraak nucleïnezuren
 naamgeving:
֍ pyrimidines: “naam base” -idine (uracil  uridine)
֍ purines: “naam base” -osine (adenine  adenosine)
o nucleotiden
 nucleoside met fosfo-ester binding met fosfaatgroep op 5’
 kunnen binding vormen tussen 3’-hydroxyl op suiker van ene nucleotide en
5’-fosfaat van andere nucleotide
 ter vorming lange nucleotidenketens
deoxyribonucleïnezuur (DNA) / ribonucleïnezuur (RNA)

,o naamgeving basen, nucleosiden en nucleotiden
 “mono” en C’-nummering weggelaten




 alle ribonucleosiden en deoxyribonucleosiden komen in de cel ook voor
onder hun 5’-difosfaatvorm en 5’-trifosfaatvorm
bv: adenosine-trifosfaat

, Structuur van dubbele helix
o Nucleïnezuren dragers van hoge negatieve ladingsdensiteit
o Primaire structuur
 Fosfodiëster binding: -C-O-P-
 Invariant: ruggengraat van fosfodiëster-suikerbindingen
 Variabel: volgorde basen die genetische informatie codeert
 Lineaire polynucleotideketen heeft gedefinieerde richting
֍ 5’ (P)  3’ (OH)
o Secundaire en ruimtelijke structuur
 Basenparing op basis van complementariteit = Watson-Crick basenparing
֍ Purine-pyrimidine
֍ A-T/(U) (2 H-bruggen)
֍ G-C (3 H-bruggen)
 Ontstaan duplex molecule = dubbelstrengig (DNA)
 Elke streng 5’  3’ polariteit
 MAAR: Antiparallelle oriëntatie  strengen verschillen in polariteit




 3D-dubbele helicale structuur van antiparallelle ketens schroefsgewijs
 Draairichting rechts  basenringen gestapeld boven elkaar = stacking
hydrofoob binnenste en hydrofiel buitenste
o Conformaties
 ss DNA: enkelstrengig
 ds DNA: dubbelstrengig
 CCC DNA: circulair
֍ 5’ P en 3’ OH uiteinden zijn covalent gebonden
֍ In ds CCC DNA zijn dus 2 strengen:
⁃ Covalent gebonden met zichzelf
⁃ Topologisch gebonden met elkaar
⁃ De helix is eveneens om eigen as gewonden  superhelix
 OC/NC DNA: open of genicked circulair DNA
֍ Breuk in 1 keten zodat DNA niet tot superhelix is gerold
o Bijzondere sequenties
 Direct repeats: identieke sequentie met zelfde polariteit in zelfde streng



 Inverted repeats: sequenties
zijn in 5’3’ gelijk in beide strengen




 Antiparallelle
herhaling: sequenties zijn
assymmetrisch (polariteit!)

, o Bijzondere terminologie
 1 bp: 1 basepaar
֍ 0,34 nm (=afstand tussen 2 nucleotiden)
 1 kb(p): 1 kilobasen(paren)
֍ Enkelstrengig nucleïnezuur: 1000 nucleotiden
֍ Dubbelstrengig nucleïnezuur: 1000 baseparen
֍ 0,34 µm
 Megadalton (MDa) = 106 dalton
 1 MDA = 3000 nucleotiden of 1500 bp
 1 kbp = 0,66 MDa
 Fysico-chemische analyse
o U.V. absorptie
 geconjugeerde dubbele bindingen in de basen vertonen resonantie met
maximale A bij 260 nm
 uitgedrukt in optische densiteit (OD)
֍ 1 OD = de gewichtshoeveelheid DNA of RNA die, opgelost in 1 ml,
een A van 1 veroorzaakt over 1 cm weglengte
֍ 1 OD ds DNA = 50 µg
֍ 1 OD ss DNA = 38µg
֍ 1 OD RNA = 40µg
o Denaturatie
 DNA ontwinden tot wanordelijke “random coils”
 ds DNA  ss DNA
 Verbreken van waterstofbindingen maar niet fosfodiëster ruggengraat
 Denaturerende agentia
֍ Ureum, formamide, formaldehyde
 Invloed pH
֍ Zure pH  protonatie verbreken β-glycosidische binding
DNA keten defragmenteren
֍ Basische pH deprotonatie, fosfaatgroepen volledig geïoniseerd
elektrostatische afstoting  ss DNA
 Invloed T
֍ smelten van ds DNA: eerste zwakke schakels dan rest als rits
⁃ regio met hoger A-T bp gehalte zijn zwak
֍ Verandering van ds naar ss kwantitatief te volgen
⁃ ss DNA absorbeert meer UV licht dan ds
⁃ A neemt toe met 40% = hyperchroom effect
⁃ A260 in functie van T = smeltcurve van DNA
⁃ Tm =T waar DNA half-gedenatureerd is (midden
smeltcurve)
⁃ Tm is maat voor G-C gehalte