5. Microscopie
5.1 FLUORESCENTIEMICROSCOPIE
= nood aan licht om fluorescentie op te wekken
- Excitatielicht:
o Schijnen op fluorescente moleculen
o Absorberen van licht
o Moleculen gaan naar een hogere energie
o Energie vrijgeven door het licht uit te sturen
Moleculen in aangeslagen toestand brengen (en uiteindelijk terug naar de
grondtoestand)
- Energie van excitatielicht > energie van fluorescentielicht (je verliest zo energie)
Blauw: excitatie spectrum
Groen: fluorescentie spectrum/emissie spectrum
→ kleine verschuiving tussen beide
Curve: drukken de waarschijnlijkheid uit waarmee
de excitatie/emissie zal gebeuren bij een bepaalde
golflengte
➔ We kunnen hier verschillende kleuren van licht voor gebruiken:
- Zwak signaal: intensiteit van het excitatielicht verhogen
= meer excitatie van de molecule
= meer fluorescentielicht
- Saturatie: molecule zit aan zijn maximale capaciteit (kan geen extra fluorescentie
opwekken)
- Proces van excitatie en emissie van fluorescentielicht eindigt: molecule verlies hun
eigenschappen en doven uit
Signaal kan je verbeteren door intenser excitatielicht te gerbuiken, maar moleculen
kunnen uitdoven!!
5.1.1 EPI-FLUORESCENTIE
= Breedveld-microscopie: volledige specimen bestralen met
excitatielicht (zeer gevoelige techniek)
= vanaf dat er ergens fluorescentie ontstaat, kunnen wij dat
detecteren
Werking:
- Lichtbron: stuurt licht van verschillende golflengtes
- Excitatiefilter: we hebben bij een specifieke golflengte de
kans dat de molecule wordt geëxciteerd
, - Geselecteerde licht projecteren op specimen
- Fluorescente moleculen exciteren en sturen een licht met een langere golflengte uit
- Licht door emissiefilter (enkel meest waarschijnlijke golflengte detecteren →
achtergrondsignaal tegenhouden)
- Beeld vormen
Nadeel:
- Beperkte lokalisatie: we weten niet goed waar het fluorescent signaal vandaan komt
- Informatie van de fluorescente moleculen is beperkt naar ruimtelijke locatie toe: soms is
dat wel nodig → we willen een optische snede definiëren
= op een bepaalde diepte in het specimen een beeld vormen (zoals coupes maken)
5.1.2.A CONFOCALE MICROSCOPIE
= je kan de optische coupe zo beter definiëren doorheen het specimen
Werking:
- Pinhole gebruiken voor de lichtbron en de detector (enkel licht doorheen het gat wordt
op het specimen geprojecteerd/gedetecteerd)
= op focaal vlak krijgen we een scherp puntje van excitatielicht en van
fluorescentielicht/emissielicht
= 2 pinholes die samen gefocusseerd worden in het focale vlak van de microscoop
- Enkel in een bepaald punt van het focale vlak exciteren (gevoelig voor het
fluorescentielicht door die pinhole)
We plaatsen een pinhole voor de detector: licht
vanuit het focale vlak detecteren (omdat die door de
pinhole kan)
→ Licht boven/onder het focale vlak wordt
tegengehouden
EPI-FLUORESCENTIE CONFOCALE MICROSCOPIE
Groot achtergrondsignaal Klein achtergrondsignaal (signaal van boven
en onder het focaal vlak kan je tegenhouden)
Moeilijke lokalisatie Makkelijke lokalisatie
Verschillende termen voor dezelfde technieken:
- LSM: Laser Scanning Microscopy
- CSLM: Confocal Scanning Laser Microscopy
- …
, Pinhole bepaald resolutie van confocale microscoop
= overweging maken tussen resolutie en sensitiviteit (dikte van de snede)
- Dunne pinhole: goede resolutie
- Dikke pinhole: mindere resolutie, grotere sensitiviteit
Nadelen:
- Veel delen van specimen verlichten zonder ze te gebruiken voor de beeldvorming
- Specimen constant blootstellen aan excitatielicht die we niet gaan gebruiken voor de
beeldvorming
= foto-bleaching/foto-toxiciteit (als je te intens licht gebruikt)
- = appertief gebruiken met een hogere luminieke apertuur
Opletten: als je werkt met een pinhole, is de microscoop
gevoeliger voor sferische/chromatische abberaties
Stel: je werkt met een microscoop die is
ingesteld op een dekglaasje, en je werkt
steeds verder en verder van het glas
= microscoop is niet meer goed afgesteld
= ontstaan van sferische abberaties
= niet al het licht geraakt nog door de pinhole
Voor verschillende kleuren kan je een verschillende focale afstand hebben: worden
dus op een verschillende afstand van het dekglaasje scherp gesteld (je moet hier
correcties op uitvoeren om de beelden te laten overeenkomen
5.1.2.B FLUORESCENTIE CORRELATIE SPECTROSCOPIE (FCS)
= hoe de intensiteit van fluorescentielicht veranderd door de tijd heen
= verschillende tijdsmomenten in de tijd bekijken voor hetzelfde punt
= verandering in intensiteit bekijken
FCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectrocscopy)
= kijken naar verband tussen 2 kleuren
= als moleculen gaan binden, zullen de signalen correleren → als het ene molecule voorbij de
meetapparatuur komt, doet de andere dat ook
a) Moleculen gebonden: beide
signalen tegelijk opmeten (groene en
rode pieken komen overeen)
b) Moleculen niet gebonden: signaal is
niet gecorreleerd (piek in het groen
betekend niet automatisch een piek in
de andere kleur)
5.1 FLUORESCENTIEMICROSCOPIE
= nood aan licht om fluorescentie op te wekken
- Excitatielicht:
o Schijnen op fluorescente moleculen
o Absorberen van licht
o Moleculen gaan naar een hogere energie
o Energie vrijgeven door het licht uit te sturen
Moleculen in aangeslagen toestand brengen (en uiteindelijk terug naar de
grondtoestand)
- Energie van excitatielicht > energie van fluorescentielicht (je verliest zo energie)
Blauw: excitatie spectrum
Groen: fluorescentie spectrum/emissie spectrum
→ kleine verschuiving tussen beide
Curve: drukken de waarschijnlijkheid uit waarmee
de excitatie/emissie zal gebeuren bij een bepaalde
golflengte
➔ We kunnen hier verschillende kleuren van licht voor gebruiken:
- Zwak signaal: intensiteit van het excitatielicht verhogen
= meer excitatie van de molecule
= meer fluorescentielicht
- Saturatie: molecule zit aan zijn maximale capaciteit (kan geen extra fluorescentie
opwekken)
- Proces van excitatie en emissie van fluorescentielicht eindigt: molecule verlies hun
eigenschappen en doven uit
Signaal kan je verbeteren door intenser excitatielicht te gerbuiken, maar moleculen
kunnen uitdoven!!
5.1.1 EPI-FLUORESCENTIE
= Breedveld-microscopie: volledige specimen bestralen met
excitatielicht (zeer gevoelige techniek)
= vanaf dat er ergens fluorescentie ontstaat, kunnen wij dat
detecteren
Werking:
- Lichtbron: stuurt licht van verschillende golflengtes
- Excitatiefilter: we hebben bij een specifieke golflengte de
kans dat de molecule wordt geëxciteerd
, - Geselecteerde licht projecteren op specimen
- Fluorescente moleculen exciteren en sturen een licht met een langere golflengte uit
- Licht door emissiefilter (enkel meest waarschijnlijke golflengte detecteren →
achtergrondsignaal tegenhouden)
- Beeld vormen
Nadeel:
- Beperkte lokalisatie: we weten niet goed waar het fluorescent signaal vandaan komt
- Informatie van de fluorescente moleculen is beperkt naar ruimtelijke locatie toe: soms is
dat wel nodig → we willen een optische snede definiëren
= op een bepaalde diepte in het specimen een beeld vormen (zoals coupes maken)
5.1.2.A CONFOCALE MICROSCOPIE
= je kan de optische coupe zo beter definiëren doorheen het specimen
Werking:
- Pinhole gebruiken voor de lichtbron en de detector (enkel licht doorheen het gat wordt
op het specimen geprojecteerd/gedetecteerd)
= op focaal vlak krijgen we een scherp puntje van excitatielicht en van
fluorescentielicht/emissielicht
= 2 pinholes die samen gefocusseerd worden in het focale vlak van de microscoop
- Enkel in een bepaald punt van het focale vlak exciteren (gevoelig voor het
fluorescentielicht door die pinhole)
We plaatsen een pinhole voor de detector: licht
vanuit het focale vlak detecteren (omdat die door de
pinhole kan)
→ Licht boven/onder het focale vlak wordt
tegengehouden
EPI-FLUORESCENTIE CONFOCALE MICROSCOPIE
Groot achtergrondsignaal Klein achtergrondsignaal (signaal van boven
en onder het focaal vlak kan je tegenhouden)
Moeilijke lokalisatie Makkelijke lokalisatie
Verschillende termen voor dezelfde technieken:
- LSM: Laser Scanning Microscopy
- CSLM: Confocal Scanning Laser Microscopy
- …
, Pinhole bepaald resolutie van confocale microscoop
= overweging maken tussen resolutie en sensitiviteit (dikte van de snede)
- Dunne pinhole: goede resolutie
- Dikke pinhole: mindere resolutie, grotere sensitiviteit
Nadelen:
- Veel delen van specimen verlichten zonder ze te gebruiken voor de beeldvorming
- Specimen constant blootstellen aan excitatielicht die we niet gaan gebruiken voor de
beeldvorming
= foto-bleaching/foto-toxiciteit (als je te intens licht gebruikt)
- = appertief gebruiken met een hogere luminieke apertuur
Opletten: als je werkt met een pinhole, is de microscoop
gevoeliger voor sferische/chromatische abberaties
Stel: je werkt met een microscoop die is
ingesteld op een dekglaasje, en je werkt
steeds verder en verder van het glas
= microscoop is niet meer goed afgesteld
= ontstaan van sferische abberaties
= niet al het licht geraakt nog door de pinhole
Voor verschillende kleuren kan je een verschillende focale afstand hebben: worden
dus op een verschillende afstand van het dekglaasje scherp gesteld (je moet hier
correcties op uitvoeren om de beelden te laten overeenkomen
5.1.2.B FLUORESCENTIE CORRELATIE SPECTROSCOPIE (FCS)
= hoe de intensiteit van fluorescentielicht veranderd door de tijd heen
= verschillende tijdsmomenten in de tijd bekijken voor hetzelfde punt
= verandering in intensiteit bekijken
FCCS (Fluorescence Cross-Correlation Spectrocscopy)
= kijken naar verband tussen 2 kleuren
= als moleculen gaan binden, zullen de signalen correleren → als het ene molecule voorbij de
meetapparatuur komt, doet de andere dat ook
a) Moleculen gebonden: beide
signalen tegelijk opmeten (groene en
rode pieken komen overeen)
b) Moleculen niet gebonden: signaal is
niet gecorreleerd (piek in het groen
betekend niet automatisch een piek in
de andere kleur)
