Samenvatting - Moleculaire biologie

Hoofdstuk 2: genstructuur, genexpressie en het genoom

, Hoofdstuk 0: zelfstudies
Inhoudstafel 2. DNA-sequenties nodig voor transcriptie
(1) TATA box
Inhoudstafel
(2) Transcriptie start site

1. Inleiding (3) Regulatorische elementen

2. Proces en betrokken eiwitten 3. Factoren nodig voor transcriptie
Interacties tussen deze factoren
3. DNA replicatie bij prokaryoten
Basale transcriptieapparaat
Proteïnen
4. Functie van activators en repressors
4. DNA replicatie is stabiel: (3) oorzaken
Invloed op GTFs
5. Soorten DNA-polymerasen Invloed op mediator
Invloed op chromatinestructuur
1. Eiwitsynthese bij eukaryoten

1. Structuur en functie van nucleïnezuren
2. Genen
1.1. Chemie van nucleïnezuren
3. Transcriptie bij prokaryoten 1.2. Basenparen en de dubbele helix

5. Transcriptie bij eukaryoten 1.3. Genen, transcriptie en de centrale dogma theorie

Elementen
2. Structuur en functie van chromosomen

1. Algemeen 2.1. Organisatie
2.2. Chromosoom functie
2. Soorten RNA-processing
(1) Splicing 3. DNA en chromosomen in de celcyclus

(2) Capping (5’) 3.1. Verschillen in DNA kopieën

(3) Poly-adenylatie (3’) 3.2. De celcyclus
3.3. Mitose
1. Genetische code
3.4. Meiose
Frameshiftmutaties (leesraamwijziging)
3.5. Mitochondriëel DNA
2. Translatieapparaat: (5) componenten
1. Eiwit-coderende genen: structuur en expressie
(1) Ribosomen: synthese polypeptide
1.1. Genen: exonen en intronen
(2) tRNA: aanvoer polypeptiden
1.2. Post-translationele modificaties
(3) Aminoacyl tRNA-synthasen: hechten AZ aan tRNA
(4) mRNA: coderen van juiste AZ sequentie 2. RNA genen en non-coding RNA
2.1. RNA genen
3. Ribosomen in pro- en eukaryoten
2.2. ncRNA
4. Translatieprorces bij prokaryoten 2.3. RNA world hypothese
2.4. Uitzonderlijke structuur van RNA
1. Inleiding
2.5. Regulatorische RNA modellen (3)
2. Mechanismen van transcriptionele regulatie
3. Het genoom
(1) Regulatorische transcriptiefactoren
3.1. The human genome project
(2) Kleine effectormoleculen
3.2. Analyses van sequenties
3. Operator-operon 3.3. The ENCODE project
Lac operon
4. Organisatie en evolutie van het genoom
4. Negatieve controle van het repressor-eiwit 4.1. Mechanismen die ons genoom bepalen
(1) Lac-operon – inductie 4.2. Functioneel deel van het genoom
(2) Trp-operon – repressie 4.3. Gendistributie in het menselijk genoom
Lac- vs. trp-operons 4.4. Repetitief DNA

5. Positieve controle van het activator eiwit 4.5. Pseudogenen
4.6. Organisatie van genfamilies
6. Repressible vs. inducible operons
4.7. Genduplicatie en repetitief coding-DNA
1. Inleiding 4.8. Transposons: jumping genes

, Hoofdstuk 0: zelfstudies
4.9. Hoog-repetitief non-coding DNA in menselijk genoom 3.3. Projecten die genetische variatie onderzoeken
3.4. Polymorfisme dankzij variatie in aantal tandem repeats
1. Kloneren van DNA
3.5. Structurele variatie: (2) soorten
1.1. Stap 1: maken van recombinant DNA
3.6. Genetische variatie tussen mensen
1.2. Stap 2: transformatie
1.3. Stap 3: amplificatie 4. Functionele genetische variatie
1.4. Stap 4: opzuiveren 4.1. Gen inactivatie
4.2. Genetische variatie: vaak neutraal, soms schadelijk
2. PCR = Polymerase Chain Reaction
4.3. Positieve selectie: voorbeelden
2.1. Taq polymerase
2.2. Stap 1: scheiden 5. Genetische variatie in het immuunsysteem
2.3. Stap 2: vasthaken 5.1. Inleiding immuunsysteem
2.4. Stap 3: vermeerderen 5.2. Antilichamen
5.3. T-celreceptor (TcR)
3. Real-time PCR (qPCR)
5.4. Majeur Histocompatibiliteitscomplex (MHC)
3.1. Methode
5.5. Out of Africa theorie
3.2. Soorten fluoroforen
5.1. Introductie
4. Nucleïnezuurhybridisatie 1.2. Stambomen
4.1. Nucleïnezuur probes
2. Mendeliaanse en mitochondriale overervingspatronen
4.2. Vorming van duplexen
2.1. Autosomaal dominant
4.3. Principes van nucleïnezuurhybridisatie
2.2. Autosomaal recessief
4.4. Hybridization assays
2.3. X-gebonden
4.5. DNA microarrays
2.4. Pseudoautosomale overerving
5. Elektroforese en blotting 2.5. Y-gebonden overerving
5.1. Agarose gelelektroforese 2.6. Mitochondriële overerving
5.2. Capillaire gelelektroforese
3. Complicerende factoren bij overerving
5.3. Southern Blotting
3.1. De Novo mutatie
6. DNA sequencing 3.2. Kiemlijnmozaïcisme
6.1. Dideoxy sequencing = Sanger sequencing 3.3. Locus heterogeniteit
6.2. Next-generation sequencing 3.4. Verminderde penetrantie

7. Klonen van zoogdieren 3.5. Variabele expressie

7.1. Adulte cellen klonen (nucleaire transfer): Dolly 4. Allelfrequenties in populaties

8. Overzicht technieken 4.1. Hardy-Weinberg principe
4.2. Factoren die de allelfrequentie kunnen veranderen
1. Oorsprong van genetische variaties
4.3. Random genetische drift
1.1. Mutaties
4.4. Mutatie vs. selectie
1.2. Endogene fouten bij replicatie en celdeling: (2) soorten
4.5. Heterozygoot voordeel
1.3. Beschadiging van chemische structuur
1.4. Typen van DNA beschadiging 5. Pleiotropie
5.2. Mucoviscidose (cystische fibrose)
2. DNA herstel
2.1. Schade aan één streng 1. Fundamentele karakteristieken & evolutie van kanker

2.2. Schade aan beide strengen 1.1. Genetische ziekte

2.3. Onopgemerkte DNA-schade 1.2. Terminologie

2.4. DNA-herstel ziekten 1.3. Indeling van tumoren

2.5. DNA-herstel polymerasen 1.4. Tumorgenese

2.6. Overzicht mechanismen 2. Onevenwicht tussen celproliferatie en celdood

3. Inventaris van genetische variatie bij de mens 2.1. Signaalpathways

3.1. Terminologie 2.2. Ontstaan van kanker

3.2. DNA varianten 2.3. Kankercellen verwerven nieuwe eigenschappen

, Hoofdstuk 0: zelfstudies
2.4. Stamcellen en kanker

3. Oncogenen en tumor supressor genen
3.1. Soorten mutaties
3.2. Oncogenen
3.3. Tumor supressor genen
3.3. Oncogenen vs. tumor supressorgenen

, Hoofdstuk 0: zelfstudies
Proteïnen
Deel 1: DNA replicatie
1. Inleiding DNA-helicase: scheiding dubbelstreng – aan elke vork - 5! → 3′ -
verbruikt ATP
DNA replicatie = identieke kopieën maken van DNA wanneer cel
deelt; volgens AT/GC regel: Single strand binding proteins: houden strengen gescheiden.
 A=T
 C≡G DNA-topoisomerase: “reist” voor replicatievork – heft spanningen
DNA regelt zijn eigen duplicatie. vd windingen op
Nucleotide = suiker + fosfaatgroep + base DNA-primase: maakt primers – RNA primer

DNA-polymerase: maakt DNA – verwijdert primers en vult gaten

2. Proces en betrokken eiwitten DNA-ligase: plakt Okazaki fragmenten aan elkaar dmv covalente
bindingen
1. Initiatie
Replicon = replicatie-eenheid
Origin of replication = plek waar DNA synthese start; initiator
ontwindt streng. 4. DNA replicatie is stabiel: (3) oorzaken
2. Lokale ontwinding 1) H-bruggen: alleen correcte bp vormen stabiele H-bruggen;
verkeerde combinaties vallen spontaan uiteen
DNA-helicase ontwindt de streng van 5! → 3′
2) Selectiviteit DNA-polymerase: vormt enkel bindingen bij
 Breekt H-bruggen tussen base dmv ATP-hydrolyse
correcte bp
 Vorming replicatievork
3) Proofreading: DNA-polymerase detecteert + verwijdert
Topoisomerasen = DNA gyrasen maken kleine breuken in
dubbele helix om supercoiling te voorkomen foutieve nucleotiden (3! → 5′ exonuclease-activiteit)
 Single strand binding proteins hechten op ontwonden strengen
om samenklitting te voorkomen

3. RNA priming
DNA-polymerase kan enkel nucleotiden koppelen aan bestaande 5. Soorten DNA-polymerasen
nucleotideketens. Evolutie: mutaties zorgen voor verschillende DNA-polymerasen.
 RNA primers toegevoegd door DNA-primase Prokaryoten hebben minder soorten dan eukaryoten.
 Primer is complementair aan DNA
Primers in leading strand (5! → 3′): 1 primer
Primers in lagging strand (3! → 5′): meerdere

4. Elongatie
DNA-polymerase:
 5! → 3′
 Deoxynucleoside trifosfaten binden template strand
 DNA-polymerase breekt binding tussen 1e en 2de
fosfaatgroep (energie vrij)
§ Nucleotide met 1 fosfaatgroep wordt aangehecht op
template strand met phospoester bond

Leading strand: 1
Lagging strand: okazaki fragmenten, telkens tot primer van
volgend fragment.

Bidirectionele replicatie want replicatie gebeurt in beide richtingen.

5. Ligatie
Exonuclease (= DNA polymerase 1) verwijdert RNA primers en vult
lege plekjes met DNA (er ontbreekt telkens 1 covalente binding).

Ligase plakt fragmenten aan elkaar.


3. DNA replicatie bij prokaryoten
DNA-primase maakt RNA primers
DNA-polymerase III hangt nucleotiden aan primers
In lagging strand verwijdert het meteen de primers en
vervangt deze door DNA
DNA-ligase plakt fragmenten aan elkaar.

, Hoofdstuk 0: zelfstudies

Welke proteïnen zijn belangrijk bij DNA replicatie? (1 lijn per proteïne).

DNA-helicase: ontwindt de dubbele helix door waterstofbruggen tussen DNA-strengen te verbreken

DNA-topoisomerase: voorkomt supercoiling door spanningen voor de replicatievork op te heffen

Single-strand binding proteins: binden enkelstrengig DNA en houden het open / stabiel

DNA-polymerase III: bouwt de nieuwe DNA-streng door toevoeging va nucleotiden

DNA-polymerase I: verwijderd RNA-primers en vervangt ze door DNA (bij prokaryoten)

DNA-ligase: verbindt Okazaki-fragmenten op de lagging strand door fosfodiësterbindingen

Sliding clamp: houdt DNA-polymerase op zijn plaats tijdens replicatie

Clamp loader: helpt bij het vastmaken van de slidingclamp aan DNA

Initiator-eiwitten: herkennen de origin of replication en starten replicatie

, Hoofdstuk 0: zelfstudies

Deel 2: Transcriptie = RNA synthese
1. Eiwitsynthese bij eukaryoten Elementen
Centrale dogma: DNA → transcriptie → RNA → translatie → Promotor: bindingsplaats voor RNA-polymerase – signaal voor
proteïne transcriptie start
Transcriptie: DNA afgelezen tot pre-mRNA (DNA blijft Regulatorische sequentie: bindingsplaats voor regulatorische
onveranderd) proteïnen – bepalen transcriptiesnelheid – verspreid voorkomen

RNA processing = intronen verwijderd → matuur mRNA Getranscripteerde regio: bevat info voor AZ-sequentie – matrijs
Translatie: matuur mRNA vertaald tot eiwit (niet-coderend) – coderende streng

2. Genen Terminator: signaal voor transcriptie einde
Gen: DNA-fragment met info voor eiwitsynthese
o Structurele genen coderen voor eiwitten.
o Niet-structurele genen coderen voor RNA (geen
translatie)

Transcriptie-eenheid: continue DNA-fragment dat in één transcript
wordt overgeschreven.

UTR’s:
 5’-UTR (leader): voor coderende sequentie, 5’-cap
 3’-UTR (trailer): na coderende sequentie, poly-A-staart

Promotor: startpunt
Terminator: stoppunt
Regulatorische sequentie: bindingsplek voor regulerende eiwitten;
bepaald transcriptiesnelheid

Spacers: DNA tussen 2 genen

3. Transcriptie bij prokaryoten
1. Binding
RNA-polymerase herkent promotor met startsignalen

2. Initiatie
Sigma factor bindt promotor
RNA-polymerase bindt sigma factor → verbreekt dubbele helix van
3! → 5′; vorming open complex

3. Elongatie
Nucleotiden van RNA streng groeien van 5! → 3′
 Template strand: DNA streng die gekopieerd wordt
 Coding strand: DNA streng met dezelfde sequentie als
mRNA
Na het open complex sluit de DNA streng weer.

4. Terminatie
RNA-polymerase komt een terminatiesignaal tegen.



5. Transcriptie bij eukaryoten
Er zijn enkele verschillen:
Prokaryoten Eukaryoten
1 soort RNA-polymerase: 3 soorten RNA-polymerase:
- Maakt mRNA van alle - I en III: maken
soorten genen mRNA van niet-
structurele genen
- II: maken mRNA van
structurele genen
1 sigma factor nodig om
promotor te herkennen 5 transcriptiefactoren nodig
om te starten

Gelijkenissen: promotors + 3 stappen (initiatie, elongatie en
terminatie)

, Hoofdstuk 0: zelfstudies

Bespreek het proces van DNA transcriptie en maak schematische tekeningen.

DNA wordt overgeschreven naar RNA in drie stappen: initiatie, elongatie en terminatie.
Transcriptie gebeurt tussen een promotor (start) en terminator (stop) op het DNA.

1. Initiatie
Voor prokaryoten: de sigma factor bindt aan RNA-polymerase en vormt een holo-enzym
 Sigma herkent de promotor op het DNA
 DNA wordt lokaal ontwonden en opent een open complex
 Start transcriptie bij +1 positie (ATP-afhankelijk)

Voor eukaryoten: RNA-polymerase II veresit 5 algemene transcritpiefactoren
 TFIID herkent de TATA-box via subeenheid TBP (tata-binding protein)
 TFIIH herkent helicase-activiteit en opent DNA
Dit vormt het pre-initiation complex (PIC).

2. Elongatie
Sigma factor (prokaryoten) of initiatiefactoren (eukaryoten) vallen af.
RNA-polymerase glijft over DNA en synthetiseert mRNA:
 In 5! → 3′ richting (dus template streng = 3! → 5′)
 Nieuwe RNA-streng is complementair aan de template strand
Coding strand ≈ RNA-sequentie (behalve 𝑇 → 𝑈)

3. Terminatie
Voor prokaryoten:
Rho-onafhankelijk waarbij transcriptie stopt bij een hairpin-structuur in RNA + poly-U;
Rho-afhankelijk waarbij het Rho-eiwit bindt aan RNA en het RNA-polymerase wegduwt.

Voor eukaryoten:
RNA-polymerase II loopt voorbij de terminator → RNA wordt afgeplist door endonucleasen en RNA-polymerase valt van het DNA.

, Hoofdstuk 0: zelfstudies

Deel 3: RNA processing
Functies:
1. Algemeen § Helpt bij export mRNA uit nucleus
Doel: omzetting pre-mRNA naar matuur mRNA § Verhoogt stabiliteit van mRNA in cytosol
Intronen: niet-coderende stukken (verwijderd) § Bij bacteriën verlaagt het juist de stabiliteit
Exonen: coderende stukken (behouden)

1. Initiatie
2. 5’ capping
3. Terminatie van transcriptie
4. Splicing (verwijderen van intronen
5. 3’-polyadenylatie (toevoegen Poly-A-staart)


2. Soorten RNA-processing

(1) Splicing
Intronen = niet-coderende regio’s, worden verwijderd
Exonen = coderende regio’s, blijven behouden
Spliceosomen knippen intronen uit pre-mRNA.
Self-splicin introns: knippen zichzelf zonder spliceosoom
 Werken als riboenzymen (RNA met enzymfunctie)
 Komt voor bij tRNA en rRNA

Spliceosoom:
§ Bestaat uit snRNP’s (small nuclear RNA + eiwitten)
§ snRNA = eindproduct van een niet-structureel gen

Proces:
Spliceosoom herkent intron-RNA: 5’-splice site, branch site, 3’-
splice site
↓
Spliceosoom bindt op deze plekken
↓
Intron wordt ‘uit streng geduwd’ en 2 exonen aan de rand komen
dichter bij elkaar
↓
5’-kant wordt geknipt door spliceosoom + verbonden met branch
site
↓
3’ kant wordt geknipt
↓

Exonen worden covalent gebonden
↓
Intronen worden afgebroken door ribonucleases
** 5’ splice kant = splice donor
** 3’ splice kant = splice acceptor

Alternatieve splicing: soms worden bepaalde exonen mee
verwijderd; hierdoor ontstaan verschillende eiwitten uit één gen.


(2) Capping (5’)
Aan het 5’-uiteinde wordt een 7-methylguanosine
(gemodificeerde guanosine) toegevoegd.

Functies:
§ Herkenningssignaal voor binding aan ribosoom
§ Transport uit nucleus:
- Cap wordt herkend door cap-binding proteins
- Deze helpen bij nucleair export van mature mRNA


(3) Poly-adenylatie (3’)
Toevoeging van een poly-A-staart (reeks adenines) aan het 3’-
uiteinde. Wordt niet gecodeerd in DNA, maar achteraf
toegevoegd na transcriptie.

, Hoofdstuk 0: zelfstudies

Omschrijf de stappen van RNA processing.

RNA-processing = reeks modificaties aan pre-mRNA in eukaryoten, om het om te vormen tot matuur mRNA. Dit is nodig vooraleer het RNA de
kern verlaat en vertaald wordt naar een eiwit. Het komt niet voor bij de meeste prokaryoten.

Intronen = niet-coderende sequenties, worden verwijderd
Exonen = coderende sequenties, blijven behouden

Stappen van RNA-processing:
1. Splicing
Intronen = niet-coderende regio’s, worden verwijderd
Exonen = coderende regio’s, blijven behouden
Spliceosomen knippen intronen uit pre-mRNA.
Self-splicin introns: knippen zichzelf zonder spliceosoom
 Werken als riboenzymen (RNA met enzymfunctie)
 Komt voor bij tRNA en rRNA

Spliceosoom:
§ Bestaat uit snRNP’s (small nuclear RNA + eiwitten)
§ snRNA = eindproduct van een niet-structureel gen

Proces:
Spliceosoom herkent intron-RNA: 5’-splice site, branch site, 3’-splice site
↓
Spliceosoom bindt op deze plekken
↓
Intron wordt ‘uit streng geduwd’ en 2 exonen aan de rand komen dichter bij elkaar
↓
5’-kant wordt geknipt door spliceosoom + verbonden met branch site
↓
3’ kant wordt geknipt
↓

Exonen worden covalent gebonden
↓
Intronen worden afgebroken door ribonucleases
** 5’ splice kant = splice donor
** 3’ splice kant = splice acceptor

Alternatieve splicing: soms worden bepaalde exonen mee verwijderd; hierdoor ontstaan verschillende eiwitten uit één gen

2. 5’ capping
Aan het 5’-uiteinde wordt een 7-methylguanosine (gemodificeerde guanosine) toegevoegd.

Functies:
§ Herkenningssignaal voor binding aan ribosoom
§ Transport uit nucleus:
- Cap wordt herkend door cap-binding proteins
- Deze helpen bij nucleair export van mature mRNA

3. 3’-polyadenylatie
Toevoeging van een poly-A-staart (reeks adenines) aan het 3’-uiteinde. Wordt niet gecodeerd in DNA, maar achteraf toegevoegd na
transcriptie.

Functies:
§ Helpt bij export mRNA uit nucleus
§ Verhoogt stabiliteit van mRNA in cytosol
§ Bij bacteriën verlaagt het juist de stabiliteit