Inhoudsopgave
HISTOLOGIE ...........................................................................................................................................................14
BLOED ................................................................................................................................................................. 105
CYTOLOGIE .......................................................................................................................................................... 131
Integument ......................................................................................................................................................... 204
1
,H1b inleiding - microscopische waarnemingsmethoden
1. Inleiding
• Microscopie:
o Mikros: klein, skopeo: kijken
o Basis voor de pathologie -> vooral beschrijvend
o Levende processen zichtbaar maken
o EXA: schematisch een structuur kunnen schetsen
1.1 begrippen
• resolutie = kleinste afstand waarmee 2 punten nog net gescheiden
kunnen worden
o 0.2mm met het blote oog
o 0.2µm met lichtmicroscoop
▪ Mitochondriën: heel klein puntje, niet elk puntje
is een mitochondriën
o 0.1µm met elektronenmicroscoop
▪ Elektronen gebruikt als lichtbron
o EXA: grootte kunnen schatten van iets
• Grootte gemiddelde cel = 2 micrometer
• F
o n = brekingsindex, d = resolutie
o a = halve tophoek
(helft van hoek van lichtstralen die in het objectief landt)
1.2 weefselvoorbereiding
• probleem: 2D/3D voorstellingsvermogen
o in coupes/sneden werken
o weefsels zo goed mogelijk bewaren zodat ze nog zo
goed als origineel zijn
▪ moet zo snel mogelijk gebeuren, kan door
fixatie:
• immersie (onderdompelen) of
perfusie (via bloedbaan)
• sterkere fixatie -> processen van afbreken meer stoppen
• LM: paraformaldehyde, TEM: glatuuraldehyde
Van orgaan naar coupe
We kunnen het weefsel niet gewoon in was (parafine) leggen want dit is waterafstotend
-> weefsel eerst dehydrateren in bv atenol
• Afhankelijk van welk weefsel je wilt zien en welke microscoop er wordt gebruikt
2
,1.3 verschillende microscopen
• Van Leeuwenhoek:
o Eerste microscoop: ‘enkelvoudige microscoop’ (maar 1 lens)
o Wou kwaliteit van zijn draden (textielfabriek) controleren
• Hierna: lichtmicroscoop, elektronenmicroscoop
2. Lichtmicroscoop
2.1 eigenschappen
• basisinstrument
= samengestelde conventionele lichtmicroscoop (2 lenzen)
o beeld door eerste lens wordt gevormd
-> vergroot door 2de lens
verkregen vergroting is heel wat hoger dan bij de enkele lens
2.2 onderdelen lichtmicroscoop
• Helderveld-LM
• statief, objecttafel / preparaattafel, lichtbron, diafragma, …..
• optiek: 3 lenssystemen:
o oculair
= vergroting van beeld en projectie op netvlies van het oog
o objectief
= vormt tussenbeeld en bepaalt grotendeels de vergroting
o condensor
= set lenzen die de straal van de lichtbron opvangen en ze via breking tot
een coherente, smalle lichtbundel herleiden
= bundelt het licht op het preparaat
▪ nodig want anders zou veel van de lichtsterkte verloren gaan
• wanneer een object zich in het focaal vlak bevindt van een lens
-> afbeelding wordt op oneindig geprojecteerd
• Lenstheorie: zie afbeeldingen dia 25-34
o Lichtstralen door midden -> niet gebroken
o D0 = afstand voorwerp tot lens
o D0 > 2f
-> verkleint en omgekeerd
o D0 = 2f
-> even groot en omgekeerd
o F < d0 < 2f
-> vergroot en omgedraaid
o D0 = f
-> geen beeldvorming, lichtstralen blijven parallel na breking
o D0 < f
-> vergroot virtueel beeld, aan zelfde kant als object
• Licht wordt aangepast bij veranderde vergroting
o Vergroting van lichtmicroscoop
= vergroting objectief x vergroting oculair
3
,2.3 resolutie (R) en numerieke aperatuur (NA)
• resolutie = vermogen van een microscoop om 2 punten op een coupe als afzonderlijk te kunnen
waarnemen
o bij de beste lichtmicroscopen: R = 0.2 µm
• numerieke aperatuur = kwaliteitswaardemeter voor objectief
• formule R en NA:
𝜆
R= NA = n•sinµ
𝑁𝐴
- hoe hoger NA -> hoe beter R (want R wordt kleiner)
- hoe korter 𝜆 -> hoe beter R
• stel: objectief van 40x en 10x
-> die van 40x staat het dichtst bij het preparaat
• betekenissen op lens:
o kleurband: zegt of het gedroogde lens is (kan je die voor olie ofz gebruiken)
o Plan-APOCHROMAT: indicaties dat lens gecorrigeerd is voor lensfouten
o Roze: lens is ook gecorrigeerd voor dikte van het lensglaasje
▪ Licht moet eerst door draagglaasje, dan weefsel en dan dekglaasje
-> brekingsindex zou anders zijn -> hierdoor correctie
o Kan tot dekglaasje van 0.17mm dik!
2.4 preparatie van paraffinecoupes
• voor mooie snedes moeten we hard weefsel krijgen -> paraffine
• paraffinecoupes
o orgaan fixeren door perfusie of immersie
▪ degradatie van weefsel door bacteriën en enzymen tegengaan
weefsel naspoelen
weefsel dehydrateren (=ontwateren)
inbedden in paraffine
microtoomcoupes worden gesneden (ong 5µm dik)
= zeer zunne schijfjes van weefselblokje
▪ coupe = schijfje weefsel
▪ opgelet: je krijgt allemaal soorten doorsneden!
• Overlangse, dwarse of schuine
opvangen op draagglaasje en drogen
weefsel terug in waterig milieu om gekleurd te worden
na de kleuring wordt de coupe terug ontwatert -> wordt ingesloten met een niet-
waterig inbeddingsmedium om uitdroging te voorkomen
4
, kleuring weefsel
• noodzakelijk om contrast te bekomen
o niet gekleurd weefsel heeft ong zelfde brekingsindex als glas
-> zou in gewone lichtmicroscoop met doorvallend licht weinig zichtbaar zijn
• kleuringsproces verleent kleur aan het weefsel -> verschillende structuren zichtbaar
• veelgebruikte overzichtskleuring
o hematoxyline (bindt aan zuren)
o eosine (bindt aan basische stoffen)
3. Andere microscopische technieken
3.1 fasecontrastmicroscopie
= op de plaats van faseverschillen die het object veroorzaakt, worden kunstmatige
helderheidsverschillen aangebracht
- beeld toont de juiste geometrische vorm van details
- kunnen in levende cellen nog inwendige structuren onderscheiden
• structuren van ongekleurde preparaten zijn met het blote oog / in microscoop met normale
helderveldverlichting slecht of helemaal niet waarneembaar
(structuren hebben min of meer zelfde brekingsindex)
o lichtgolven die op diverse plaatsen door zo een preparaat heengaan verschillen alleen in
hun fase
• lichtgolven die door een object lopen worden vertraagd
o gebruik van interferentie om meer intense en donkere gebieden te creëren: diepte-effect
3.2 differentiaal interferentiecontrast
• is beter bruikbaar bij dikkere preparaten en bij grotere brekingsindexverschillen dan
fasecontrast
• maakt gebruik van principes uit de polarisatiemicroscopie voor de contrastering van
faseobjecten
4. fluorescentiemicroscopie
• Er wordt gebruik gemaak van fluorescente kleurstoffen en kleuringen om structuren in
stalen zichtbaar te maken en fysiologische processen te kunnen volgen
• Fluorescentie
= eigenschap van bepaalde atomen en moleculen om licht van een bepaalde golflengte te
absorberen en na een korte tijd (=fluorescence lifetime) terug uit te zenden met een
langere golflengte
• De lichtenergie v/h excitatielicht zal na absorptie de fluorescente molecule naar hogere
energietoestand brengen -> er gaat E verloren
Molecule geeft zijn E terug vrij onder de vorm van emissielicht
o Emissielicht heeft een lagere E, dus een langere 𝜆 dan excitatielicht
o De kleur van emissielicht is verschillend van die van excitatielicht
5
, • Zichtbaar spectrum van licht: 400nm – 700nm
o Korte 𝜆 -> hoge f, hoge E
o Lange 𝜆 -> lage f, lage E
4.1 fluorochromen
• fluorochromen hebben excitatie- en emissiespectra
• het verschil tss de maxima van absorptie- en emissiespectra = Stokes shift
Epifluorescentie met gereflecteerd licht
• het lichtpad zorgt ervoor dat de juiste golflengte (=kleur) op het
specimen valt en het licht met een langere golflengte het oog
(of camera) bereikt
• de dichroïsche spiegel zal licht met een korte 𝜆 reflecteren en licht met
een lange 𝜆 doorlaten
o dichroïsche spiegel = spiegel geplaatst op een hoek van 45°
tov de invallende lichtstraal
▪ laat licht van lange golflengte door
Voorbeelden van fluorochromen
• autofluorescentie
= fluoresceren uit zichtzelf (zenden licht uit wanneer ze licht absorberen)
o planten: pollenkorrels, chloroplasten
o dieren: bepaalde pigmenten (haar)
• immunohistochemische kleuringen: verbonden met antilichamen (direct of indirect)
= zeer specifieke antilichamen opwekken tegen antigenen en deze antilichamen direct of indirect
labelen met een fluorescente merker
o antilichamen worden aangemaakt in een dier tegen een bepaald epitoop van een eiwit
-> wanneer ze op weefsel/cellen worden gebracht zullen deze antilichamen binden aan
het eiwit waartegen ze zijn opgewekt
als aan deze fluorochromen zijn verbonden is het mogelijk deze te zien in een
fluorescentiemicroscoop
▪ traditionele fluorescente kleurstoffen: FITC, DAPI, Hoechst dyes
▪ cyanine dyes: Cy3, Cy5, Cy7
▪ Alexa Fluor dyes: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568
▪ Quantum dots
6
HISTOLOGIE ...........................................................................................................................................................14
BLOED ................................................................................................................................................................. 105
CYTOLOGIE .......................................................................................................................................................... 131
Integument ......................................................................................................................................................... 204
1
,H1b inleiding - microscopische waarnemingsmethoden
1. Inleiding
• Microscopie:
o Mikros: klein, skopeo: kijken
o Basis voor de pathologie -> vooral beschrijvend
o Levende processen zichtbaar maken
o EXA: schematisch een structuur kunnen schetsen
1.1 begrippen
• resolutie = kleinste afstand waarmee 2 punten nog net gescheiden
kunnen worden
o 0.2mm met het blote oog
o 0.2µm met lichtmicroscoop
▪ Mitochondriën: heel klein puntje, niet elk puntje
is een mitochondriën
o 0.1µm met elektronenmicroscoop
▪ Elektronen gebruikt als lichtbron
o EXA: grootte kunnen schatten van iets
• Grootte gemiddelde cel = 2 micrometer
• F
o n = brekingsindex, d = resolutie
o a = halve tophoek
(helft van hoek van lichtstralen die in het objectief landt)
1.2 weefselvoorbereiding
• probleem: 2D/3D voorstellingsvermogen
o in coupes/sneden werken
o weefsels zo goed mogelijk bewaren zodat ze nog zo
goed als origineel zijn
▪ moet zo snel mogelijk gebeuren, kan door
fixatie:
• immersie (onderdompelen) of
perfusie (via bloedbaan)
• sterkere fixatie -> processen van afbreken meer stoppen
• LM: paraformaldehyde, TEM: glatuuraldehyde
Van orgaan naar coupe
We kunnen het weefsel niet gewoon in was (parafine) leggen want dit is waterafstotend
-> weefsel eerst dehydrateren in bv atenol
• Afhankelijk van welk weefsel je wilt zien en welke microscoop er wordt gebruikt
2
,1.3 verschillende microscopen
• Van Leeuwenhoek:
o Eerste microscoop: ‘enkelvoudige microscoop’ (maar 1 lens)
o Wou kwaliteit van zijn draden (textielfabriek) controleren
• Hierna: lichtmicroscoop, elektronenmicroscoop
2. Lichtmicroscoop
2.1 eigenschappen
• basisinstrument
= samengestelde conventionele lichtmicroscoop (2 lenzen)
o beeld door eerste lens wordt gevormd
-> vergroot door 2de lens
verkregen vergroting is heel wat hoger dan bij de enkele lens
2.2 onderdelen lichtmicroscoop
• Helderveld-LM
• statief, objecttafel / preparaattafel, lichtbron, diafragma, …..
• optiek: 3 lenssystemen:
o oculair
= vergroting van beeld en projectie op netvlies van het oog
o objectief
= vormt tussenbeeld en bepaalt grotendeels de vergroting
o condensor
= set lenzen die de straal van de lichtbron opvangen en ze via breking tot
een coherente, smalle lichtbundel herleiden
= bundelt het licht op het preparaat
▪ nodig want anders zou veel van de lichtsterkte verloren gaan
• wanneer een object zich in het focaal vlak bevindt van een lens
-> afbeelding wordt op oneindig geprojecteerd
• Lenstheorie: zie afbeeldingen dia 25-34
o Lichtstralen door midden -> niet gebroken
o D0 = afstand voorwerp tot lens
o D0 > 2f
-> verkleint en omgekeerd
o D0 = 2f
-> even groot en omgekeerd
o F < d0 < 2f
-> vergroot en omgedraaid
o D0 = f
-> geen beeldvorming, lichtstralen blijven parallel na breking
o D0 < f
-> vergroot virtueel beeld, aan zelfde kant als object
• Licht wordt aangepast bij veranderde vergroting
o Vergroting van lichtmicroscoop
= vergroting objectief x vergroting oculair
3
,2.3 resolutie (R) en numerieke aperatuur (NA)
• resolutie = vermogen van een microscoop om 2 punten op een coupe als afzonderlijk te kunnen
waarnemen
o bij de beste lichtmicroscopen: R = 0.2 µm
• numerieke aperatuur = kwaliteitswaardemeter voor objectief
• formule R en NA:
𝜆
R= NA = n•sinµ
𝑁𝐴
- hoe hoger NA -> hoe beter R (want R wordt kleiner)
- hoe korter 𝜆 -> hoe beter R
• stel: objectief van 40x en 10x
-> die van 40x staat het dichtst bij het preparaat
• betekenissen op lens:
o kleurband: zegt of het gedroogde lens is (kan je die voor olie ofz gebruiken)
o Plan-APOCHROMAT: indicaties dat lens gecorrigeerd is voor lensfouten
o Roze: lens is ook gecorrigeerd voor dikte van het lensglaasje
▪ Licht moet eerst door draagglaasje, dan weefsel en dan dekglaasje
-> brekingsindex zou anders zijn -> hierdoor correctie
o Kan tot dekglaasje van 0.17mm dik!
2.4 preparatie van paraffinecoupes
• voor mooie snedes moeten we hard weefsel krijgen -> paraffine
• paraffinecoupes
o orgaan fixeren door perfusie of immersie
▪ degradatie van weefsel door bacteriën en enzymen tegengaan
weefsel naspoelen
weefsel dehydrateren (=ontwateren)
inbedden in paraffine
microtoomcoupes worden gesneden (ong 5µm dik)
= zeer zunne schijfjes van weefselblokje
▪ coupe = schijfje weefsel
▪ opgelet: je krijgt allemaal soorten doorsneden!
• Overlangse, dwarse of schuine
opvangen op draagglaasje en drogen
weefsel terug in waterig milieu om gekleurd te worden
na de kleuring wordt de coupe terug ontwatert -> wordt ingesloten met een niet-
waterig inbeddingsmedium om uitdroging te voorkomen
4
, kleuring weefsel
• noodzakelijk om contrast te bekomen
o niet gekleurd weefsel heeft ong zelfde brekingsindex als glas
-> zou in gewone lichtmicroscoop met doorvallend licht weinig zichtbaar zijn
• kleuringsproces verleent kleur aan het weefsel -> verschillende structuren zichtbaar
• veelgebruikte overzichtskleuring
o hematoxyline (bindt aan zuren)
o eosine (bindt aan basische stoffen)
3. Andere microscopische technieken
3.1 fasecontrastmicroscopie
= op de plaats van faseverschillen die het object veroorzaakt, worden kunstmatige
helderheidsverschillen aangebracht
- beeld toont de juiste geometrische vorm van details
- kunnen in levende cellen nog inwendige structuren onderscheiden
• structuren van ongekleurde preparaten zijn met het blote oog / in microscoop met normale
helderveldverlichting slecht of helemaal niet waarneembaar
(structuren hebben min of meer zelfde brekingsindex)
o lichtgolven die op diverse plaatsen door zo een preparaat heengaan verschillen alleen in
hun fase
• lichtgolven die door een object lopen worden vertraagd
o gebruik van interferentie om meer intense en donkere gebieden te creëren: diepte-effect
3.2 differentiaal interferentiecontrast
• is beter bruikbaar bij dikkere preparaten en bij grotere brekingsindexverschillen dan
fasecontrast
• maakt gebruik van principes uit de polarisatiemicroscopie voor de contrastering van
faseobjecten
4. fluorescentiemicroscopie
• Er wordt gebruik gemaak van fluorescente kleurstoffen en kleuringen om structuren in
stalen zichtbaar te maken en fysiologische processen te kunnen volgen
• Fluorescentie
= eigenschap van bepaalde atomen en moleculen om licht van een bepaalde golflengte te
absorberen en na een korte tijd (=fluorescence lifetime) terug uit te zenden met een
langere golflengte
• De lichtenergie v/h excitatielicht zal na absorptie de fluorescente molecule naar hogere
energietoestand brengen -> er gaat E verloren
Molecule geeft zijn E terug vrij onder de vorm van emissielicht
o Emissielicht heeft een lagere E, dus een langere 𝜆 dan excitatielicht
o De kleur van emissielicht is verschillend van die van excitatielicht
5
, • Zichtbaar spectrum van licht: 400nm – 700nm
o Korte 𝜆 -> hoge f, hoge E
o Lange 𝜆 -> lage f, lage E
4.1 fluorochromen
• fluorochromen hebben excitatie- en emissiespectra
• het verschil tss de maxima van absorptie- en emissiespectra = Stokes shift
Epifluorescentie met gereflecteerd licht
• het lichtpad zorgt ervoor dat de juiste golflengte (=kleur) op het
specimen valt en het licht met een langere golflengte het oog
(of camera) bereikt
• de dichroïsche spiegel zal licht met een korte 𝜆 reflecteren en licht met
een lange 𝜆 doorlaten
o dichroïsche spiegel = spiegel geplaatst op een hoek van 45°
tov de invallende lichtstraal
▪ laat licht van lange golflengte door
Voorbeelden van fluorochromen
• autofluorescentie
= fluoresceren uit zichtzelf (zenden licht uit wanneer ze licht absorberen)
o planten: pollenkorrels, chloroplasten
o dieren: bepaalde pigmenten (haar)
• immunohistochemische kleuringen: verbonden met antilichamen (direct of indirect)
= zeer specifieke antilichamen opwekken tegen antigenen en deze antilichamen direct of indirect
labelen met een fluorescente merker
o antilichamen worden aangemaakt in een dier tegen een bepaald epitoop van een eiwit
-> wanneer ze op weefsel/cellen worden gebracht zullen deze antilichamen binden aan
het eiwit waartegen ze zijn opgewekt
als aan deze fluorochromen zijn verbonden is het mogelijk deze te zien in een
fluorescentiemicroscoop
▪ traditionele fluorescente kleurstoffen: FITC, DAPI, Hoechst dyes
▪ cyanine dyes: Cy3, Cy5, Cy7
▪ Alexa Fluor dyes: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568
▪ Quantum dots
6
