Moleculaire biologie
Inhoud
1. Grondleggers van de moleculaire biologie ........................................................... 4
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal............................................ 4
1.2 Een model voor de structuur van DNA .......................................................... 5
1.3 Het centrale dogma .................................................................................... 5
2. De structuur van DNA ........................................................................................ 6
2.1 De primaire structuur van DNA .................................................................... 6
2.2 De secundaire structuur ............................................................................. 7
2.3 Denaturatie en renaturatie van DNA ............................................................. 8
2.4 De tertiaire structuur .................................................................................. 9
3. Genoomorganisatie en evolutie ........................................................................ 10
3.1 Vele genoomsequenties zijn ontrafeld ........................................................ 10
3.2 Variaties in genoomorganisatie .................................................................. 11
3.3 Eukaryote genomen bevatten veel repetitief DNA ........................................ 12
3.4 Extrachromosomaal DNA en horizontale gentransfer .................................. 14
3.5 Genenclusters.......................................................................................... 16
3.6 Het menselijk genoomproject .................................................................... 17
3.7 Polymorfisme binnen het menselijk genoom .............................................. 17
3.8 Genoomsequenties van hominiden (grote apen) ......................................... 18
3.9 Condensatie van het genoom .................................................................... 18
4. DNA replicatie ................................................................................................. 21
4.1 DNA replicatie is semi-conservatief ........................................................... 21
4.2 DNA replicatie gebeurt meestal bidirectioneel ............................................ 22
4.3 DNA polymerasen katalyseren DNA synthese van 5' naar 3' ......................... 23
4.4 Multi-eiwit moleculaire machines verzorgen DNA replicatie ......................... 24
4.5 Topo-isomerasen relaxeren “supercoiled” DNA........................................... 27
4.6 Specifieke kenmerken van eukaryote DNA replicatie ................................... 28
4.7 Laboratoriumtechnieken gebaseerd op DNA replicatie ................................ 28
4.7.1 Sanger sequenering ........................................................................... 28
5. DNA schade en herstelmechanismen ............................................................... 30
1
, 5.1 Mutaties en DNA schade ................................................................................ 30
5.2 Mutaties op nucleotide niveau ........................................................................ 31
5.3 Structurele beschadiging van de dubbele helix ................................................ 33
5.4 DNA herstelmechanismen ............................................................................. 33
5.4.1 Mismatch-repair ..................................................................................... 33
5.4.2 Base excision repair ................................................................................ 34
5.4.3 Nucleotide excision repair ....................................................................... 35
5.4.4 Non-homologous End Joining (NHEJ) ........................................................ 35
5.4.5 Homologe recombinatie .......................................................................... 36
5.4.6 Geadapteerd CRISPR CAS9 systeem als toolbox om gericht genomische
varianten te introduceren ................................................................................. 37
6. Het ontstaan van genetische variatie ................................................................ 39
6.1 Puntmutaties ........................................................................................... 39
6.2 Genherschikkingen ................................................................................... 40
6.2.1 Transposons...................................................................................... 40
6.2.2 Retrotransposons en retrovirussen ..................................................... 41
6.2.3 Meiose .............................................................................................. 42
6.2.4 Homologe recombinatie..................................................................... 42
6.2.5 Antilichaamdiversiteit: Somatische recombinatie ................................ 45
6.3 Variaties op chromosoomniveau................................................................ 46
6.4 Variaties op genoomniveau ....................................................................... 47
7. Transcriptie en RNA maturatie ............................................................................. 48
7.1 De structuur van RNA .................................................................................... 48
7.2 De boodschapper tussen DNA en eiwit is RNA ................................................. 49
7.3 Basiskenmerken van transcriptie .................................................................... 51
7.4 Transcriptie bij prokaryoten ............................................................................ 52
7.4.1 De promotor ........................................................................................... 52
7.4.2 Het RNA polymerase ............................................................................... 53
7.4.3 Regulatie van transcriptie ........................................................................ 55
7.4.4 Transcriptie terminatie ............................................................................. 57
7.5 Transcriptie bij eukaryoten ............................................................................. 58
7.5.1 Eukaryoten hebben meerdere RNA polymerasen ....................................... 58
2
, 7.5.2 Eukaryote CIS-elementen ........................................................................ 58
7.5.3 Eukaryote TRANS-factoren ....................................................................... 59
7.5.4 DNA condensatie en transcriptionele regulatie .......................................... 64
7.5.5 Transcriptie door RNA polymerase I en III en mitochondriale transcriptie ..... 69
7.5.6 Transcriptie terminatie ............................................................................. 69
7.6 RNA maturatie ............................................................................................... 70
7.6.1 5’ Capping ......................................................................................... 71
7.6.2 3’ Polyadenylatie ............................................................................... 71
7.6.3 mRNA splicing ................................................................................... 72
7.6.4 mRNA editing .................................................................................... 75
7.6.5 mRNA transport ................................................................................. 76
7.6.6 mRNA stabiliteit ................................................................................ 76
7.6.7 RNA interferentie ............................................................................... 77
7.7 rRNA en tRNA maturatie ............................................................................ 81
7.7.1 rRNA maturatie .................................................................................. 81
7.7.2 tRNA maturatie .................................................................................. 82
8. Eiwitsynthese en eiwitadressering .................................................................... 83
8.1 De genetische code gekraakt .......................................................................... 83
8.2 Het ribosoom ................................................................................................ 84
8.3 De eiwitsynthese ........................................................................................... 84
8.3.1 tRNAs en aminoacyl-tRNA synthetasen .................................................... 85
8.3.2 Het translatieproces ................................................................................ 86
8.4 Gereguleerde eiwitafbraak ............................................................................. 91
8.5 Eiwitadressering ............................................................................................ 93
8.5.1 Sortering van eiwitten aangemaakt op vrij ribosomen ................................. 93
8.5.2 Sortering via het ER en Golgi..................................................................... 95
8.5.3 Endocytose en sortering van opgenomen eiwitten ....................................101
8.5.4 Adressering van eiwitten voor lysosomale afbraak ....................................103
3
, 1. Grondleggers van de moleculaire biologie
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal
Frederick Griffith (1928): het ‘transforming principle’
Experiment met 2 bacteriestammen
- Rough: niet virulent
- Smooth: virulent
1) Muis is dood
2) Muis leeft, maar is ziek; kan bacterie elimineren
3) Muis is dood, heeft uit het bloed een cultuur gemaakt
van levende smooth bacteriën
➔ Genetisch materiaal van dode, virulente bacteriën (S) werd overgedragen op levende,
niet-virulente (R) bacteriën, waardoor deze ziekmakend werden. → de R-stam heeft
een transforming factor.
Avery, McLeod en McCarthy (1944): DNA is het “transforming principle”
- Ze elimineerden eerst vetten en suikers en koken het
mengsel (waardoor bacteriën stierven)
- Er worden in drie buisjes specifieke enzymen
toegevoegd
- Levende R cellen toevoegen en kijken of ze virulent
worden
- Wanneer S cellen behandeld werden met proteasen
of ribonucleasen => wel transformatie naar levende S-
cellen (dus spelen geen rol)
- Transformase gebeurt niet wanneer DNA kapot
gemaakt is
- DNA = transformerende factor MAAR de wetenschap gelooft dit nog niet doordat
men de verkeerde structuur van DNA in gedachten had
- Wat zou een beperking kunnen zijn van het experiment? Je kon niet 100% zeker
zijn dat de enzymen specifiek waren en dat ze dus maar 1 type biomolecule
konden afbreken
Alfred Hershey & Martha Chase (1950)
Experiment met bacteriofagen = virussen die bacteriën infecteren, bestaan enkel uit
eiwit en DNA
Wanneer bacteriofagen bacteriën infecteren dan injecteren ze een substantie in de
bacteriën die instrueert om nieuwe faagpartikels aan te maken.
4
Inhoud
1. Grondleggers van de moleculaire biologie ........................................................... 4
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal............................................ 4
1.2 Een model voor de structuur van DNA .......................................................... 5
1.3 Het centrale dogma .................................................................................... 5
2. De structuur van DNA ........................................................................................ 6
2.1 De primaire structuur van DNA .................................................................... 6
2.2 De secundaire structuur ............................................................................. 7
2.3 Denaturatie en renaturatie van DNA ............................................................. 8
2.4 De tertiaire structuur .................................................................................. 9
3. Genoomorganisatie en evolutie ........................................................................ 10
3.1 Vele genoomsequenties zijn ontrafeld ........................................................ 10
3.2 Variaties in genoomorganisatie .................................................................. 11
3.3 Eukaryote genomen bevatten veel repetitief DNA ........................................ 12
3.4 Extrachromosomaal DNA en horizontale gentransfer .................................. 14
3.5 Genenclusters.......................................................................................... 16
3.6 Het menselijk genoomproject .................................................................... 17
3.7 Polymorfisme binnen het menselijk genoom .............................................. 17
3.8 Genoomsequenties van hominiden (grote apen) ......................................... 18
3.9 Condensatie van het genoom .................................................................... 18
4. DNA replicatie ................................................................................................. 21
4.1 DNA replicatie is semi-conservatief ........................................................... 21
4.2 DNA replicatie gebeurt meestal bidirectioneel ............................................ 22
4.3 DNA polymerasen katalyseren DNA synthese van 5' naar 3' ......................... 23
4.4 Multi-eiwit moleculaire machines verzorgen DNA replicatie ......................... 24
4.5 Topo-isomerasen relaxeren “supercoiled” DNA........................................... 27
4.6 Specifieke kenmerken van eukaryote DNA replicatie ................................... 28
4.7 Laboratoriumtechnieken gebaseerd op DNA replicatie ................................ 28
4.7.1 Sanger sequenering ........................................................................... 28
5. DNA schade en herstelmechanismen ............................................................... 30
1
, 5.1 Mutaties en DNA schade ................................................................................ 30
5.2 Mutaties op nucleotide niveau ........................................................................ 31
5.3 Structurele beschadiging van de dubbele helix ................................................ 33
5.4 DNA herstelmechanismen ............................................................................. 33
5.4.1 Mismatch-repair ..................................................................................... 33
5.4.2 Base excision repair ................................................................................ 34
5.4.3 Nucleotide excision repair ....................................................................... 35
5.4.4 Non-homologous End Joining (NHEJ) ........................................................ 35
5.4.5 Homologe recombinatie .......................................................................... 36
5.4.6 Geadapteerd CRISPR CAS9 systeem als toolbox om gericht genomische
varianten te introduceren ................................................................................. 37
6. Het ontstaan van genetische variatie ................................................................ 39
6.1 Puntmutaties ........................................................................................... 39
6.2 Genherschikkingen ................................................................................... 40
6.2.1 Transposons...................................................................................... 40
6.2.2 Retrotransposons en retrovirussen ..................................................... 41
6.2.3 Meiose .............................................................................................. 42
6.2.4 Homologe recombinatie..................................................................... 42
6.2.5 Antilichaamdiversiteit: Somatische recombinatie ................................ 45
6.3 Variaties op chromosoomniveau................................................................ 46
6.4 Variaties op genoomniveau ....................................................................... 47
7. Transcriptie en RNA maturatie ............................................................................. 48
7.1 De structuur van RNA .................................................................................... 48
7.2 De boodschapper tussen DNA en eiwit is RNA ................................................. 49
7.3 Basiskenmerken van transcriptie .................................................................... 51
7.4 Transcriptie bij prokaryoten ............................................................................ 52
7.4.1 De promotor ........................................................................................... 52
7.4.2 Het RNA polymerase ............................................................................... 53
7.4.3 Regulatie van transcriptie ........................................................................ 55
7.4.4 Transcriptie terminatie ............................................................................. 57
7.5 Transcriptie bij eukaryoten ............................................................................. 58
7.5.1 Eukaryoten hebben meerdere RNA polymerasen ....................................... 58
2
, 7.5.2 Eukaryote CIS-elementen ........................................................................ 58
7.5.3 Eukaryote TRANS-factoren ....................................................................... 59
7.5.4 DNA condensatie en transcriptionele regulatie .......................................... 64
7.5.5 Transcriptie door RNA polymerase I en III en mitochondriale transcriptie ..... 69
7.5.6 Transcriptie terminatie ............................................................................. 69
7.6 RNA maturatie ............................................................................................... 70
7.6.1 5’ Capping ......................................................................................... 71
7.6.2 3’ Polyadenylatie ............................................................................... 71
7.6.3 mRNA splicing ................................................................................... 72
7.6.4 mRNA editing .................................................................................... 75
7.6.5 mRNA transport ................................................................................. 76
7.6.6 mRNA stabiliteit ................................................................................ 76
7.6.7 RNA interferentie ............................................................................... 77
7.7 rRNA en tRNA maturatie ............................................................................ 81
7.7.1 rRNA maturatie .................................................................................. 81
7.7.2 tRNA maturatie .................................................................................. 82
8. Eiwitsynthese en eiwitadressering .................................................................... 83
8.1 De genetische code gekraakt .......................................................................... 83
8.2 Het ribosoom ................................................................................................ 84
8.3 De eiwitsynthese ........................................................................................... 84
8.3.1 tRNAs en aminoacyl-tRNA synthetasen .................................................... 85
8.3.2 Het translatieproces ................................................................................ 86
8.4 Gereguleerde eiwitafbraak ............................................................................. 91
8.5 Eiwitadressering ............................................................................................ 93
8.5.1 Sortering van eiwitten aangemaakt op vrij ribosomen ................................. 93
8.5.2 Sortering via het ER en Golgi..................................................................... 95
8.5.3 Endocytose en sortering van opgenomen eiwitten ....................................101
8.5.4 Adressering van eiwitten voor lysosomale afbraak ....................................103
3
, 1. Grondleggers van de moleculaire biologie
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal
Frederick Griffith (1928): het ‘transforming principle’
Experiment met 2 bacteriestammen
- Rough: niet virulent
- Smooth: virulent
1) Muis is dood
2) Muis leeft, maar is ziek; kan bacterie elimineren
3) Muis is dood, heeft uit het bloed een cultuur gemaakt
van levende smooth bacteriën
➔ Genetisch materiaal van dode, virulente bacteriën (S) werd overgedragen op levende,
niet-virulente (R) bacteriën, waardoor deze ziekmakend werden. → de R-stam heeft
een transforming factor.
Avery, McLeod en McCarthy (1944): DNA is het “transforming principle”
- Ze elimineerden eerst vetten en suikers en koken het
mengsel (waardoor bacteriën stierven)
- Er worden in drie buisjes specifieke enzymen
toegevoegd
- Levende R cellen toevoegen en kijken of ze virulent
worden
- Wanneer S cellen behandeld werden met proteasen
of ribonucleasen => wel transformatie naar levende S-
cellen (dus spelen geen rol)
- Transformase gebeurt niet wanneer DNA kapot
gemaakt is
- DNA = transformerende factor MAAR de wetenschap gelooft dit nog niet doordat
men de verkeerde structuur van DNA in gedachten had
- Wat zou een beperking kunnen zijn van het experiment? Je kon niet 100% zeker
zijn dat de enzymen specifiek waren en dat ze dus maar 1 type biomolecule
konden afbreken
Alfred Hershey & Martha Chase (1950)
Experiment met bacteriofagen = virussen die bacteriën infecteren, bestaan enkel uit
eiwit en DNA
Wanneer bacteriofagen bacteriën infecteren dan injecteren ze een substantie in de
bacteriën die instrueert om nieuwe faagpartikels aan te maken.
4
