Histologie: van biopt tot gekleurde weefselcoupe
1 Fixatie
Doel: biopsiefragmenten onderzoeken + cel/weefsel structuren
onderscheiden
Techniek: chemische bestanddelen (EW, V, KH, Z) vastleggen
+ morfologische cellulaire structuren behouden
Effecten:
Preventie van autolyse + putrefactie
- autolyse = afbraak van cellen door enzymen -> tgv lysosomen
- putrefactie = afbraak van weefsels door bacteriële activiteit
-> gepaard met gasformatie
Behouden van cellen/weefsel bestanddelen in zo getrouw mogelijke
toestand
Harden van weefsels
Brekingsindex stijgt
Meer selectieve kleuring
Soorten fixatieven:
Formaldehyde
-> meest gebruikte fixatief
-> gas, oplosbaar in water (40% van zijn gewicht)
-> commercieel verkrijgbaar als formol (40% formaldehyde)
-> meestal 10% formoloplossing (4% formaldehyde)
-> geïncorporeerd in vele andere fixatieven
-> fosfaatbuffer aan toevoegen om oxidatie tegen te gaan
(anders verzuring met vorming van storend formolpigment)
Ethylalcohol (C2H5OH)
-> weinig nut (enkel bloeduitstrijkjes)
-> penetreert traag, verharding duurt lang
-> + andere reagentia (Carnoy’s vloeistof) -> fixatie sneller
-> effecten: - denaturatie eiwitten
- precipatie glycogeen
- lost vetten op
Aceton
-> werking analoog aan ethylalcohol (glycogeen niet goed bewaard)
-> niet meer routinematig gebruikt
Alcoholisch formol
-> bestaat uit: formol + 90% alcohol
-> soms gebruikt voor fixatie KH -> fixatie volledig na 6-8 uur
Carnoy’s vloeistof
-> bestaat uit: 100 % alcohol + chloroform + azijnzuur
-> snelle penetratie, goede kernfixatie met bewaring RER en
glycogeen
-> veroorzaakt belangrijke krimping + vernietigt meeste
cytoplasmatische
elementen
-> fixatie volledig in 1-2 uur (kleine fragmenten al na 15 min)
, 2 Inbedding
Na fixatie moet weefsel verhard worden om te kunnen snijden
soorten inbeddingsmiddelen:
o Inbedding en impregnatie met gelatine (ideaal voor bot)
o Inbedding en impregnatie met paraffine (meeste)
o Inbedding in plasticsoorten (harsen)
Paraffine inbedding:
Stap 1: dehydratatie
-> water wordt uit weefselfragmenten gehaald via alcohol reeks
-> alcohol reeks bestaat uit: serie baden met stijgende alcoholconc.
Stap 2: clearing
-> alcohol en paraffine niet mengbaar dus intermediaire vloeistof
gebruiken die
wel mengbaar is met beide -> ethanol wordt vervangen door
deze 3de vloeistof
(dan wordt het transparant)
-> soorten clearingmiddelen:
- chloroform: duurt te lang
- benzeen: zeer toxisch
- tolueen en xyleen: enkel nog gebruikt voor immunokleuring
-> kleine fragmenten klaar in 30-60 min / grote fragmenten: 2-
4 uur
- NEOCLEAR: vervangmiddel tolueen en xyleen (nu meest
gebruikt)
Stap 3: impregnatie met vloeibaar paraffine
-> paraffine verwarmen tot enkele graden boven smeltpunt (60°C)
-> weefsel wordt hier dan ingebracht
-> door de warmte verdampt neoclear en wordt progressief
vervangen door
vloeibare paraffine
Stap 4: inbedding
manueel:
-> geïmpregneerde weefselfragmenten in blokken gieten
-> weefselstuk met te snijden opp. op bodem van vorm leggen
-> overgieten met vloeibare paraffine
-> snel afkoelen om kristallisatie te voorkomen
-> na harding vorm verwijderen -> klaar om gesneden te worden
paraffinedispensor:
-> geïmpregneerde weefsel in metalen kuipje plaatsen (60°C)
-> door druk op knop: gekende hoeveelheid paraffine bedekt
weefsel
-> metalen kuipje op koelplaat -> paraffine kan inkrimpen
-> blokje kan gedemouleerd worden
3 Snijden van weefsels
Type instrumenten:
1 Fixatie
Doel: biopsiefragmenten onderzoeken + cel/weefsel structuren
onderscheiden
Techniek: chemische bestanddelen (EW, V, KH, Z) vastleggen
+ morfologische cellulaire structuren behouden
Effecten:
Preventie van autolyse + putrefactie
- autolyse = afbraak van cellen door enzymen -> tgv lysosomen
- putrefactie = afbraak van weefsels door bacteriële activiteit
-> gepaard met gasformatie
Behouden van cellen/weefsel bestanddelen in zo getrouw mogelijke
toestand
Harden van weefsels
Brekingsindex stijgt
Meer selectieve kleuring
Soorten fixatieven:
Formaldehyde
-> meest gebruikte fixatief
-> gas, oplosbaar in water (40% van zijn gewicht)
-> commercieel verkrijgbaar als formol (40% formaldehyde)
-> meestal 10% formoloplossing (4% formaldehyde)
-> geïncorporeerd in vele andere fixatieven
-> fosfaatbuffer aan toevoegen om oxidatie tegen te gaan
(anders verzuring met vorming van storend formolpigment)
Ethylalcohol (C2H5OH)
-> weinig nut (enkel bloeduitstrijkjes)
-> penetreert traag, verharding duurt lang
-> + andere reagentia (Carnoy’s vloeistof) -> fixatie sneller
-> effecten: - denaturatie eiwitten
- precipatie glycogeen
- lost vetten op
Aceton
-> werking analoog aan ethylalcohol (glycogeen niet goed bewaard)
-> niet meer routinematig gebruikt
Alcoholisch formol
-> bestaat uit: formol + 90% alcohol
-> soms gebruikt voor fixatie KH -> fixatie volledig na 6-8 uur
Carnoy’s vloeistof
-> bestaat uit: 100 % alcohol + chloroform + azijnzuur
-> snelle penetratie, goede kernfixatie met bewaring RER en
glycogeen
-> veroorzaakt belangrijke krimping + vernietigt meeste
cytoplasmatische
elementen
-> fixatie volledig in 1-2 uur (kleine fragmenten al na 15 min)
, 2 Inbedding
Na fixatie moet weefsel verhard worden om te kunnen snijden
soorten inbeddingsmiddelen:
o Inbedding en impregnatie met gelatine (ideaal voor bot)
o Inbedding en impregnatie met paraffine (meeste)
o Inbedding in plasticsoorten (harsen)
Paraffine inbedding:
Stap 1: dehydratatie
-> water wordt uit weefselfragmenten gehaald via alcohol reeks
-> alcohol reeks bestaat uit: serie baden met stijgende alcoholconc.
Stap 2: clearing
-> alcohol en paraffine niet mengbaar dus intermediaire vloeistof
gebruiken die
wel mengbaar is met beide -> ethanol wordt vervangen door
deze 3de vloeistof
(dan wordt het transparant)
-> soorten clearingmiddelen:
- chloroform: duurt te lang
- benzeen: zeer toxisch
- tolueen en xyleen: enkel nog gebruikt voor immunokleuring
-> kleine fragmenten klaar in 30-60 min / grote fragmenten: 2-
4 uur
- NEOCLEAR: vervangmiddel tolueen en xyleen (nu meest
gebruikt)
Stap 3: impregnatie met vloeibaar paraffine
-> paraffine verwarmen tot enkele graden boven smeltpunt (60°C)
-> weefsel wordt hier dan ingebracht
-> door de warmte verdampt neoclear en wordt progressief
vervangen door
vloeibare paraffine
Stap 4: inbedding
manueel:
-> geïmpregneerde weefselfragmenten in blokken gieten
-> weefselstuk met te snijden opp. op bodem van vorm leggen
-> overgieten met vloeibare paraffine
-> snel afkoelen om kristallisatie te voorkomen
-> na harding vorm verwijderen -> klaar om gesneden te worden
paraffinedispensor:
-> geïmpregneerde weefsel in metalen kuipje plaatsen (60°C)
-> door druk op knop: gekende hoeveelheid paraffine bedekt
weefsel
-> metalen kuipje op koelplaat -> paraffine kan inkrimpen
-> blokje kan gedemouleerd worden
3 Snijden van weefsels
Type instrumenten:
