Moleculaire Biologie en DNA technologie
Hoofdstuk 1: Introductie ............................................................................................................... 3
1.1 Stroom van gengetische informatie = centraal dogma ........................................................... 3
1.2 Structuur van DNA ............................................................................................................... 3
1.3 Structuur van genoom.......................................................................................................... 5
1.4 Celcyclus en celdeling ......................................................................................................... 7
1.5 DNA replicatie ..................................................................................................................... 7
Hoofdstuk 2: Schade en ontstaan van Kanker ................................................................................ 9
2.1 Mutaties .............................................................................................................................. 9
2.2 Herstelmechanismen ........................................................................................................ 10
2.3 Ontstaan van kanker .......................................................................................................... 12
Hoofdstuk 3: Technieken ............................................................................................................ 17
3.1 DNA Isolatie ...................................................................................................................... 17
3.2 Hybridisatie ....................................................................................................................... 22
3.3 PCR .................................................................................................................................. 25
3.4 Elektroforese ..................................................................................................................... 34
3.5 DNA Sequenering .............................................................................................................. 37
Hoofdstuk 4: Transcriptie ............................................................................................................ 39
4.1 Stroom van genetische informatie = centraal dogma ........................................................... 39
4.2 Structuur van RNA ............................................................................................................. 39
4.3 Soorten RNA ...................................................................................................................... 40
4.4 Synthese van RNA.............................................................................................................. 40
4.5 Maturatie van RNA ............................................................................................................. 41
Hoofdstuk 5: Genexpressie ......................................................................................................... 43
5.1 Differentiatie ..................................................................................................................... 43
5.2 Regulatie ........................................................................................................................... 43
5.3 Epigenetica ....................................................................................................................... 45
Hoofdstuk 6: RNA technieken...................................................................................................... 49
6.1 RNA islotatie ..................................................................................................................... 49
6.2 RT-(q)PCR ......................................................................................................................... 50
6.3Transcriptomics ................................................................................................................. 53
6.4 RNA sequencing ................................................................................................................ 53
Hoofstuk 7: translatie ................................................................................................................. 55
7.1 Stroom van genetische informatie = centraal dogma ........................................................... 55
7.2 Synthese van eiwitten ........................................................................................................ 55
7.3 Structuur van eiwitten ........................................................................................................ 56
1
,Hoofdstuk 8: Post-translatie ....................................................................................................... 58
8.1 Post translationele modificaties ......................................................................................... 58
8.2 signaaltransductie ............................................................................................................. 59
8.3 Eiwitexpressie ................................................................................................................... 65
Hoofdstuk 9: Technieken ............................................................................................................ 68
9.1 Heterologe eiwitexpressie .................................................................................................. 68
9.2 Proteomics........................................................................................................................ 70
9.3 Modelorganismen .............................................................................................................. 74
2
, Hoofdstuk 1: Introductie
1.1 Stroom van gengetische informatie = centraal dogma
- Stroom van genetische informatie → centrale dogma van moleculaire
biologie
→ door Francis Crick in 1957
→ DNA wordt overgeschreven naar DNA → replicatie
→ DNA wordt overgeschreven naar RNA → transcriptie (genexpressie)
→ RNA wordt vertaald naar Eiwitten → translatie
(genexpressie)
→ centrale dogma is aangevuld → Genexpressie strikt
gereguleerd op verschillende niveaus
▪ leidt tot variabiliteit (cel tot cel, organisme tot
organisme, verschillende levensfasen van een
organisme,...)
- Behoud en doorgeven van genetische informatie essentieel
→ Voor cel om te leven en te groeien
→ om nieuwe generatie cellen voor te brengen
- Genexpressie
→ proces waarbij informatie in gen ‘tot expressie’ komt → doordat gen afgelezen wordt
en RNA en eiwitten worden gemaakt
→ 2 belangrijke stappen:
▪ Transcriptie: overschrijven van DNA en vormen van mRNA)
▪ Translatie (vertalen van mRNA in eiwit)
→ RNA wordt ofwel onmiddellijk gebruikt door cel of om specifiek eiwit aan te maken.
1.2 Structuur van DNA
Primaire structuur
- DNA = desoxyribonucleïnezuur
→ Bevat alle erfelijke informatie van organisme (genetisch
materiaal)
→ Polymeer van nucleotiden
- Nucleotiden bestaan uit
→ Ribose (pentose suiker)
→ Fosfaatgroep
→ N-base
▪ Purines: adenine (A), guanine (G)
▪ Pyrimidines: cytosine (C), thymine (T)
- Nucleotiden polymeriseren door condensatiereacties
→ Fosfodiester binding tussen 3′ OH van ene nucleotide en 5’ fosfaatgroep(en) van
volgende nucleotide → Zeer stabiele binding (covalent)
→ DNA strengen hebben 2 verschillende uiteinden
▪ Richting: 5’→3’ → polariteit
→ suikers en fosfaten vormen → suiker-fosfaat ruggengraat
▪ ruggengraat altijd hetzelfde →variatie ligt in N-basen
→ volgorde van nucleotide in streng = DNA sequentie
3
, Secundaire structuur
- DNA → dubbele helix
→ model Watson en Crick, 1953
→ 2 anti-parallele DNA strengen → Baseparing ligt vast
▪ A en T //// G en C
- Verschillende zwakke krachten ondersteunen deze structuur
→ Waterstofbruggen tussen 2 complementaire basen
→ Base ‘stacking’ en elektrostatische interacties (Van der Waals) door hydrofobe
basen dicht op elkaar
- Omwentelingen → ‘grote en kleine groeve’ van DNA helix
→ Hier kunnen DNA- bindende eiwitten interacties aangaan met DNA
Tertiaire structuur
- Tertiaire structuur bij circulair DNA:
→ 2 ss strengen rond elkaar gedraaid →leidt tot over- of onderwinding van DNA
(positieve of negatieve supercoiling)
- Prokaryoot
→ Genoom is 1 (of enkele) circulair, dubbelstrengs (ds) DNA molecuul
→ Geen vrij 3’ en/of 5’ uiteinde
→ Complex met eiwitten
→ Vaak extrachromosomaal DNA: circulair ds plasmiden
→ Vaak supercoiling: over- of onderwinding
- Eukaryoot genoom
→ Chromosomaal DNA in kern als chromatine en chromosomen
→ Eukaryoot chromosoom → ontwonden tot verschillende niveaus
→ DNA‘draad’ van 2 m lengte in elke celkern
→ Gecondenseerd heterochromatine, euchromatine, chromatine-
draden
→ Geassocieerd met histonen ter vorming van nucleosomen
→ Sterke opvouwing op verschillende niveaus zichtbaar met
electronenmicroscopie
→ Chromosomen
▪ enkel zichtbaar tijdens metafase van mitose
▪ bestaat uit twee identieke chromatiden
- Eukaryoot
→ Lineair ds DNA gewonden rond 8 histonen (nucleosoom) en
extra histonen ter stabilisatie
→ Chromatine in verschillende verpakkingsgraden
▪ Heterochromatine compact → donkere vlek
• Deel ervan→ constitutief heterochromatine
o permanent gecondenseerd
o Vb centromeren en telomeren
• Facultative heterochromatine
o omgezet worden in euchromatine en
omgekeerd
▪ Euchromatine minder dens, actief
• Meeste van chromatine in metabolische actieve cellen
→ Ter voorbereiding van de celdeling wordt alle chromatine zeer dens gevouwen
4
Hoofdstuk 1: Introductie ............................................................................................................... 3
1.1 Stroom van gengetische informatie = centraal dogma ........................................................... 3
1.2 Structuur van DNA ............................................................................................................... 3
1.3 Structuur van genoom.......................................................................................................... 5
1.4 Celcyclus en celdeling ......................................................................................................... 7
1.5 DNA replicatie ..................................................................................................................... 7
Hoofdstuk 2: Schade en ontstaan van Kanker ................................................................................ 9
2.1 Mutaties .............................................................................................................................. 9
2.2 Herstelmechanismen ........................................................................................................ 10
2.3 Ontstaan van kanker .......................................................................................................... 12
Hoofdstuk 3: Technieken ............................................................................................................ 17
3.1 DNA Isolatie ...................................................................................................................... 17
3.2 Hybridisatie ....................................................................................................................... 22
3.3 PCR .................................................................................................................................. 25
3.4 Elektroforese ..................................................................................................................... 34
3.5 DNA Sequenering .............................................................................................................. 37
Hoofdstuk 4: Transcriptie ............................................................................................................ 39
4.1 Stroom van genetische informatie = centraal dogma ........................................................... 39
4.2 Structuur van RNA ............................................................................................................. 39
4.3 Soorten RNA ...................................................................................................................... 40
4.4 Synthese van RNA.............................................................................................................. 40
4.5 Maturatie van RNA ............................................................................................................. 41
Hoofdstuk 5: Genexpressie ......................................................................................................... 43
5.1 Differentiatie ..................................................................................................................... 43
5.2 Regulatie ........................................................................................................................... 43
5.3 Epigenetica ....................................................................................................................... 45
Hoofdstuk 6: RNA technieken...................................................................................................... 49
6.1 RNA islotatie ..................................................................................................................... 49
6.2 RT-(q)PCR ......................................................................................................................... 50
6.3Transcriptomics ................................................................................................................. 53
6.4 RNA sequencing ................................................................................................................ 53
Hoofstuk 7: translatie ................................................................................................................. 55
7.1 Stroom van genetische informatie = centraal dogma ........................................................... 55
7.2 Synthese van eiwitten ........................................................................................................ 55
7.3 Structuur van eiwitten ........................................................................................................ 56
1
,Hoofdstuk 8: Post-translatie ....................................................................................................... 58
8.1 Post translationele modificaties ......................................................................................... 58
8.2 signaaltransductie ............................................................................................................. 59
8.3 Eiwitexpressie ................................................................................................................... 65
Hoofdstuk 9: Technieken ............................................................................................................ 68
9.1 Heterologe eiwitexpressie .................................................................................................. 68
9.2 Proteomics........................................................................................................................ 70
9.3 Modelorganismen .............................................................................................................. 74
2
, Hoofdstuk 1: Introductie
1.1 Stroom van gengetische informatie = centraal dogma
- Stroom van genetische informatie → centrale dogma van moleculaire
biologie
→ door Francis Crick in 1957
→ DNA wordt overgeschreven naar DNA → replicatie
→ DNA wordt overgeschreven naar RNA → transcriptie (genexpressie)
→ RNA wordt vertaald naar Eiwitten → translatie
(genexpressie)
→ centrale dogma is aangevuld → Genexpressie strikt
gereguleerd op verschillende niveaus
▪ leidt tot variabiliteit (cel tot cel, organisme tot
organisme, verschillende levensfasen van een
organisme,...)
- Behoud en doorgeven van genetische informatie essentieel
→ Voor cel om te leven en te groeien
→ om nieuwe generatie cellen voor te brengen
- Genexpressie
→ proces waarbij informatie in gen ‘tot expressie’ komt → doordat gen afgelezen wordt
en RNA en eiwitten worden gemaakt
→ 2 belangrijke stappen:
▪ Transcriptie: overschrijven van DNA en vormen van mRNA)
▪ Translatie (vertalen van mRNA in eiwit)
→ RNA wordt ofwel onmiddellijk gebruikt door cel of om specifiek eiwit aan te maken.
1.2 Structuur van DNA
Primaire structuur
- DNA = desoxyribonucleïnezuur
→ Bevat alle erfelijke informatie van organisme (genetisch
materiaal)
→ Polymeer van nucleotiden
- Nucleotiden bestaan uit
→ Ribose (pentose suiker)
→ Fosfaatgroep
→ N-base
▪ Purines: adenine (A), guanine (G)
▪ Pyrimidines: cytosine (C), thymine (T)
- Nucleotiden polymeriseren door condensatiereacties
→ Fosfodiester binding tussen 3′ OH van ene nucleotide en 5’ fosfaatgroep(en) van
volgende nucleotide → Zeer stabiele binding (covalent)
→ DNA strengen hebben 2 verschillende uiteinden
▪ Richting: 5’→3’ → polariteit
→ suikers en fosfaten vormen → suiker-fosfaat ruggengraat
▪ ruggengraat altijd hetzelfde →variatie ligt in N-basen
→ volgorde van nucleotide in streng = DNA sequentie
3
, Secundaire structuur
- DNA → dubbele helix
→ model Watson en Crick, 1953
→ 2 anti-parallele DNA strengen → Baseparing ligt vast
▪ A en T //// G en C
- Verschillende zwakke krachten ondersteunen deze structuur
→ Waterstofbruggen tussen 2 complementaire basen
→ Base ‘stacking’ en elektrostatische interacties (Van der Waals) door hydrofobe
basen dicht op elkaar
- Omwentelingen → ‘grote en kleine groeve’ van DNA helix
→ Hier kunnen DNA- bindende eiwitten interacties aangaan met DNA
Tertiaire structuur
- Tertiaire structuur bij circulair DNA:
→ 2 ss strengen rond elkaar gedraaid →leidt tot over- of onderwinding van DNA
(positieve of negatieve supercoiling)
- Prokaryoot
→ Genoom is 1 (of enkele) circulair, dubbelstrengs (ds) DNA molecuul
→ Geen vrij 3’ en/of 5’ uiteinde
→ Complex met eiwitten
→ Vaak extrachromosomaal DNA: circulair ds plasmiden
→ Vaak supercoiling: over- of onderwinding
- Eukaryoot genoom
→ Chromosomaal DNA in kern als chromatine en chromosomen
→ Eukaryoot chromosoom → ontwonden tot verschillende niveaus
→ DNA‘draad’ van 2 m lengte in elke celkern
→ Gecondenseerd heterochromatine, euchromatine, chromatine-
draden
→ Geassocieerd met histonen ter vorming van nucleosomen
→ Sterke opvouwing op verschillende niveaus zichtbaar met
electronenmicroscopie
→ Chromosomen
▪ enkel zichtbaar tijdens metafase van mitose
▪ bestaat uit twee identieke chromatiden
- Eukaryoot
→ Lineair ds DNA gewonden rond 8 histonen (nucleosoom) en
extra histonen ter stabilisatie
→ Chromatine in verschillende verpakkingsgraden
▪ Heterochromatine compact → donkere vlek
• Deel ervan→ constitutief heterochromatine
o permanent gecondenseerd
o Vb centromeren en telomeren
• Facultative heterochromatine
o omgezet worden in euchromatine en
omgekeerd
▪ Euchromatine minder dens, actief
• Meeste van chromatine in metabolische actieve cellen
→ Ter voorbereiding van de celdeling wordt alle chromatine zeer dens gevouwen
4
