DEELTENTAMEN 2 GENETICA EN EVOLUTIE
H GENISOLATIE EN GENETISCHE MANIPULATIE
Leerdoelen:
- Je kunt, gebruikmakend van onderstaande technieken strategieen formuleren om
onderzoekshypotheses te testen:
- DNA extractie
- mRNA extractie
- cDNA productie
- PCR
- Gel elektroforese
- Restrictie enzymen
- Ligatie
- Kloneren/ transfectie
- Sequencing
- Microarray (H14, maar zie ook Array CGH H17)
- CRISPR/Cas 9
- Transgene dieren (boek)!
Early onset Alzeimher’s
Deze vorm van alzheimer’s is geassocieerd met 3 dominante mutaties in de volgende autosomale
genen:
1. APP (amyloid perecusor protein)
2. Presilin 1
3. Presilin 2
Gevolg: fenotype Alzheimer’s; toename A𝛽42. Het hoofdbestandsdeel hiervan zijn senile plaques.
- Vraag of het gevolg of oorzaak is
Hebben familieleden van een patient met een erfelijke aandoening dezelfde genetische
predispositie? → We zoeken dus een bekende mutatie in een gen waar de sequentie van kennen.
Hoe kunnen we testen of iemand een bekende mutatie heeft?
1. DNA extractie van de familieleden
2. PCR → mutatie detecteren
1993 PCR ontdekt door Kary Banks Mullis
,Bij een grote mutatie bestaande uit een deletie of duplicatie van >50 bp.
- PCR product op agarose gel
Bij een kleine mutatie (SNP, Insertie deletie) ontwikkel je een selectieve primer voor de deletie/ SNP.
Het wildtype allel levert geen PCR product maar de mutant wel of vice versa afhankelijk van je primer
design. Hierna zet je de PCR fragmenten op een gel.
Met ethydium bromide kunnen we het DNA aankleuren, deze wordt zichtbaar in de gel.
Probleem: met UV licht bekijken → DNA binding KAN carcinogeen betekenen.
Oxytocine:
(zelf verzonnen voorbeeld)
Neurowetenschappers stellen voor de oxytocine receptor (OXTR) te kloneren en deze vervolgens tot
expressie te brengen in een geschikt systeem zodat geautomatiseerd duizenden oxytocine analogen
kunnen worden getest.
Je wil de receptor kloneren.
1) Breng OXTR in een ander organisme tot expressie
➢ We willen een humaan gen in een ander organisme tot expressie brengen
Het gen bevat exonen en intronen, moeten die allemaal tot expressie gebracht worden? → een
bacterie kan geen intronen eruit knippen dus deze moeten eerst verwijderd worden.
Eerst moeten we de eiwit coderende sequentie van de receptor vinden.
!We zijn eigenlijk alleen geïnteresseerd in het eiwit dus we isoleren het: mRNA → hier zijn de
intronen al uit verwijderd en codeert voor het eiwit.
Stap 1: isoleer al het mRNA uit weefsel (mRNA extractie)
➢ Kleine metaalballetjes die zijn gecoat met poly-T (TTTTT)
➢ De poly-A-staart van mRNA bindt aan deze poly-T
➢ Vervolgens kun je met een magneet alle metaalballetjes eruit
vissen en dan heb je al je mRNA
➢ Je haalt de magneet weg en verbreekt met een andere buffer
de binding en dan heb je mRNA over
Nu hebben we het mRNA en gaan we dit omzetten in cDNA
Stap 2: vervolgens produceren we selectief het oxytocine receptor
cDNA dmv reverse transcriptase
➢ Reverse transcriptase heeft een primer nodig
➢ Kiest hier niet voor primer die bindt aan de poly-A-staart
want we weten welk gen we willen hebben. Dus als we
specifieke primers hebben die complementair zijn aan
dat stukje DNA dat we hebben, dan weten we zeker dat
we van al het RNA alleen maar dat ene gen dat we
zoeken amplificeren
➢ Dus je gebruikt specifieke primers
Nu kan je deze receptor gaan inbouwen in een expressie factor. Knippen, plakken, kloneren en
vectoren
,Stap 3: we kloneren het oxytocine receptor cDNA in een geschikt expressie systeem (restrictie,
ligatie, kloneren)
➢ Vector: een artificieel construct waarmee vreemd DNA in een cel kan worden gebracht
➢ Om ons cDNA in een expressie vector te kloneren maken we sticky ends
Twee methoden:
1) Gebruik speciale PCR primers om aan je gekloneerde
DNA sticky ends te maken
plaatje:
je maakt een primer en deze bindt maar op een klein
stukje van het DNA dat je wil amplificeren. Er zit ook
een stuk aan dat niet past. Dit stuk bevat wel een
sequentie met een restrictie site je graag wilt hebben.
Uiteindelijk maak je fragmenten die die restrictie sites
aan de uiteindes hebben. Deze fragmenten kun je
vervolgens met het restrictie enzym bewerken, dan krijg
je de sticky ends die je wilt hebben. Vervolgens kun je
het gen gaan inbouwen in je expressie factor die je ook
met hetzelfde enzym hebt geknipt.
2) Ligeer adapters die de gewenste restrictie sites
bevatten aan je cDNA (‘linkers’)
Plaatje:
Je hebt je PCR product, hieraan ligeer je
kleine stukjes DNA en die bevatten ook veel
restrictie sites. Vervolgens behandel je dat
stuk DNA met restrictie enzymen en dan
krijg je een fragment met de juiste uiteindes
die je nodig hebt om hem vervolgens te
plakken in je expressie factor
➢ Transfectie: je moet het in de cellen krijgen
Vectoren bevatten vaak de volgende elementen:
1. Origin of replication (Ori) → de plasmine
wordt zelf gerepliceerd in de gastheercel
2. Promotor → zodat jij transcriptie aan kan zetten wanneer jij wil
3. Cloning site → de plek waar je het gen moet inbouwen
4. Genetische markers
5. Antibiotica resistentie → (bv) als je het gen inbouwt in een bacterie dan wil je alleen
bacteriën hebben die het plasmide hebben opgenomen. Alle bacteriën die de factor
niet hebben opgenomen gaan dus automatisch dood
, 6. Reporter genen → als je de bacteriekweek eenmaal hebt worden ze (bv) blauw en
wit. De blauwe hebben het gen wat je hebt ingebouwd niet maar hebben wel de
factor, want ze groeien wel op het medium. En de witte
hebben zowel de factor als het gen dat je hebt
ingebouwd; uit deze bacteriën kan je je receptor halen.
LacZ is hier het reporter gen. Als er een groot insert zin,
het gen dat je in wilt bouwen, dat doet dat lacZ gen het
niet meer. Dat lacZ gen maakt een kleurstof. Als er iets is
ingebouwd dan maakt hij het kleurstofje niet meer, dan
kan je dus zien dat daar je insert zit
7. Eiwit opschonings-tags
Als je de vector wilt inbouwen dan wil je aan het uiteinde van je gen
restrictie sites hebben met een overhang en je vector wil je met eenzelfde restrictie enzym knippen
zodat jou DNA molecuul precies op die overhang past die cloning site.
Je moet wel controleren of die restrictie enzymen niet per ongeluk je gen stuk knippen (als je gen ook
die restrictiesites bevat). Dus je moet een restrictie enzym zoeken dat niet in je gen ligt.
Als je twee restrictie enzymen gebruikt kan je er ook nog voor zorgen dat ie maar in 1 oriëntatie erin
past.
Je kan kiezen uit twee primers:
Primer 1: bindt aan de poly-A-staart. Want je weet zeker dat mRNA een poly-A-staart
heeft
Primer 2: bindt een stukje verder
Sommige reverse transcriptases zoals HIV hebben een hele slechte proofreading. Dit is gunstig/
adaptief voor HIV. Omdat dit ervoor zorgt dat het virus de hele tijd een klein beetje veranderd. Dit
maakt dat het de hele tijd aan het immuun systeem kan ontsnappen. Als je T-killer cellen hebt die
viruseiwitten op de buitenkant van die cellen herkennen dan zijn er altijd weer varianten van het
virus in je lichaam aanwezig die weer net een ander eiwit hebben die vervolgens niet herkent wordt.
Zo blijft dat virus maar ontsnappen aan je immuun systeem.
Nadeel: in je buffer zitten wel stoffen die RNAase stuk maken?
H GENISOLATIE EN GENETISCHE MANIPULATIE
Leerdoelen:
- Je kunt, gebruikmakend van onderstaande technieken strategieen formuleren om
onderzoekshypotheses te testen:
- DNA extractie
- mRNA extractie
- cDNA productie
- PCR
- Gel elektroforese
- Restrictie enzymen
- Ligatie
- Kloneren/ transfectie
- Sequencing
- Microarray (H14, maar zie ook Array CGH H17)
- CRISPR/Cas 9
- Transgene dieren (boek)!
Early onset Alzeimher’s
Deze vorm van alzheimer’s is geassocieerd met 3 dominante mutaties in de volgende autosomale
genen:
1. APP (amyloid perecusor protein)
2. Presilin 1
3. Presilin 2
Gevolg: fenotype Alzheimer’s; toename A𝛽42. Het hoofdbestandsdeel hiervan zijn senile plaques.
- Vraag of het gevolg of oorzaak is
Hebben familieleden van een patient met een erfelijke aandoening dezelfde genetische
predispositie? → We zoeken dus een bekende mutatie in een gen waar de sequentie van kennen.
Hoe kunnen we testen of iemand een bekende mutatie heeft?
1. DNA extractie van de familieleden
2. PCR → mutatie detecteren
1993 PCR ontdekt door Kary Banks Mullis
,Bij een grote mutatie bestaande uit een deletie of duplicatie van >50 bp.
- PCR product op agarose gel
Bij een kleine mutatie (SNP, Insertie deletie) ontwikkel je een selectieve primer voor de deletie/ SNP.
Het wildtype allel levert geen PCR product maar de mutant wel of vice versa afhankelijk van je primer
design. Hierna zet je de PCR fragmenten op een gel.
Met ethydium bromide kunnen we het DNA aankleuren, deze wordt zichtbaar in de gel.
Probleem: met UV licht bekijken → DNA binding KAN carcinogeen betekenen.
Oxytocine:
(zelf verzonnen voorbeeld)
Neurowetenschappers stellen voor de oxytocine receptor (OXTR) te kloneren en deze vervolgens tot
expressie te brengen in een geschikt systeem zodat geautomatiseerd duizenden oxytocine analogen
kunnen worden getest.
Je wil de receptor kloneren.
1) Breng OXTR in een ander organisme tot expressie
➢ We willen een humaan gen in een ander organisme tot expressie brengen
Het gen bevat exonen en intronen, moeten die allemaal tot expressie gebracht worden? → een
bacterie kan geen intronen eruit knippen dus deze moeten eerst verwijderd worden.
Eerst moeten we de eiwit coderende sequentie van de receptor vinden.
!We zijn eigenlijk alleen geïnteresseerd in het eiwit dus we isoleren het: mRNA → hier zijn de
intronen al uit verwijderd en codeert voor het eiwit.
Stap 1: isoleer al het mRNA uit weefsel (mRNA extractie)
➢ Kleine metaalballetjes die zijn gecoat met poly-T (TTTTT)
➢ De poly-A-staart van mRNA bindt aan deze poly-T
➢ Vervolgens kun je met een magneet alle metaalballetjes eruit
vissen en dan heb je al je mRNA
➢ Je haalt de magneet weg en verbreekt met een andere buffer
de binding en dan heb je mRNA over
Nu hebben we het mRNA en gaan we dit omzetten in cDNA
Stap 2: vervolgens produceren we selectief het oxytocine receptor
cDNA dmv reverse transcriptase
➢ Reverse transcriptase heeft een primer nodig
➢ Kiest hier niet voor primer die bindt aan de poly-A-staart
want we weten welk gen we willen hebben. Dus als we
specifieke primers hebben die complementair zijn aan
dat stukje DNA dat we hebben, dan weten we zeker dat
we van al het RNA alleen maar dat ene gen dat we
zoeken amplificeren
➢ Dus je gebruikt specifieke primers
Nu kan je deze receptor gaan inbouwen in een expressie factor. Knippen, plakken, kloneren en
vectoren
,Stap 3: we kloneren het oxytocine receptor cDNA in een geschikt expressie systeem (restrictie,
ligatie, kloneren)
➢ Vector: een artificieel construct waarmee vreemd DNA in een cel kan worden gebracht
➢ Om ons cDNA in een expressie vector te kloneren maken we sticky ends
Twee methoden:
1) Gebruik speciale PCR primers om aan je gekloneerde
DNA sticky ends te maken
plaatje:
je maakt een primer en deze bindt maar op een klein
stukje van het DNA dat je wil amplificeren. Er zit ook
een stuk aan dat niet past. Dit stuk bevat wel een
sequentie met een restrictie site je graag wilt hebben.
Uiteindelijk maak je fragmenten die die restrictie sites
aan de uiteindes hebben. Deze fragmenten kun je
vervolgens met het restrictie enzym bewerken, dan krijg
je de sticky ends die je wilt hebben. Vervolgens kun je
het gen gaan inbouwen in je expressie factor die je ook
met hetzelfde enzym hebt geknipt.
2) Ligeer adapters die de gewenste restrictie sites
bevatten aan je cDNA (‘linkers’)
Plaatje:
Je hebt je PCR product, hieraan ligeer je
kleine stukjes DNA en die bevatten ook veel
restrictie sites. Vervolgens behandel je dat
stuk DNA met restrictie enzymen en dan
krijg je een fragment met de juiste uiteindes
die je nodig hebt om hem vervolgens te
plakken in je expressie factor
➢ Transfectie: je moet het in de cellen krijgen
Vectoren bevatten vaak de volgende elementen:
1. Origin of replication (Ori) → de plasmine
wordt zelf gerepliceerd in de gastheercel
2. Promotor → zodat jij transcriptie aan kan zetten wanneer jij wil
3. Cloning site → de plek waar je het gen moet inbouwen
4. Genetische markers
5. Antibiotica resistentie → (bv) als je het gen inbouwt in een bacterie dan wil je alleen
bacteriën hebben die het plasmide hebben opgenomen. Alle bacteriën die de factor
niet hebben opgenomen gaan dus automatisch dood
, 6. Reporter genen → als je de bacteriekweek eenmaal hebt worden ze (bv) blauw en
wit. De blauwe hebben het gen wat je hebt ingebouwd niet maar hebben wel de
factor, want ze groeien wel op het medium. En de witte
hebben zowel de factor als het gen dat je hebt
ingebouwd; uit deze bacteriën kan je je receptor halen.
LacZ is hier het reporter gen. Als er een groot insert zin,
het gen dat je in wilt bouwen, dat doet dat lacZ gen het
niet meer. Dat lacZ gen maakt een kleurstof. Als er iets is
ingebouwd dan maakt hij het kleurstofje niet meer, dan
kan je dus zien dat daar je insert zit
7. Eiwit opschonings-tags
Als je de vector wilt inbouwen dan wil je aan het uiteinde van je gen
restrictie sites hebben met een overhang en je vector wil je met eenzelfde restrictie enzym knippen
zodat jou DNA molecuul precies op die overhang past die cloning site.
Je moet wel controleren of die restrictie enzymen niet per ongeluk je gen stuk knippen (als je gen ook
die restrictiesites bevat). Dus je moet een restrictie enzym zoeken dat niet in je gen ligt.
Als je twee restrictie enzymen gebruikt kan je er ook nog voor zorgen dat ie maar in 1 oriëntatie erin
past.
Je kan kiezen uit twee primers:
Primer 1: bindt aan de poly-A-staart. Want je weet zeker dat mRNA een poly-A-staart
heeft
Primer 2: bindt een stukje verder
Sommige reverse transcriptases zoals HIV hebben een hele slechte proofreading. Dit is gunstig/
adaptief voor HIV. Omdat dit ervoor zorgt dat het virus de hele tijd een klein beetje veranderd. Dit
maakt dat het de hele tijd aan het immuun systeem kan ontsnappen. Als je T-killer cellen hebt die
viruseiwitten op de buitenkant van die cellen herkennen dan zijn er altijd weer varianten van het
virus in je lichaam aanwezig die weer net een ander eiwit hebben die vervolgens niet herkent wordt.
Zo blijft dat virus maar ontsnappen aan je immuun systeem.
Nadeel: in je buffer zitten wel stoffen die RNAase stuk maken?
