Zelfstudie DNA technieken samenvatting
DNA technieken
- Kloneren van DNA
- Polymerase kettingreactie
o Gewone PCR
o QPCR
- Nucleïnezuurhybridisatie
o Blotting technieken (Southern, Northern)
o Microarrays
- DNA sequentiebepaling
o Sanger sequencing
o Next generation sequencing
3.1 DNA klonering en PCR
Klonering= maken van stukken DNA uit 2 verschillende DNA’s dus 1 van mens bijvoorbeeld en 1 van
een dier.
DNA klonering: fractioneren en zuiveren van DNA door cellen te transformeren met
recombinant DNA
Het kloneren van DNA is een manier van DNA sequenties reinigen. Grote hoeveelheden van DNA
sequenties kunnen zo gemaakt worden dat sequenties bestudeert kunnen worden of nuttig gebruikt
kunnen worden. De cellen die gebruikt worden zijn meestal bacteriën.
Eerst moeten we de cellen behandelen op een bepaalde manier om overdracht van DNA in de cellen
moeilijk te maken = transformatie.
Het te klonen DNA worden aan een vector-DNA-sequentie gebonden die zal helpen het te repliceren
in de gastheercel.
Door het samenvoegen van DNA en vectormoleculen krijg je kunstmatig recombinant DNA dat lineair
of circulair kan zijn, zoals bij het klonen van DNA in bacteriën. Het transformatieproces is selectief:
wanneer vreemd DNA in een cel komt, wordt meestal slechts een enkele DNA-molecule opgenomen
door een cel.
Amplificatie
Het bacterieel kloneringssysteem maakt het mogelijk om grote aantallen te krijgen van het
gekloneerd DNA. Het ingevoegde DNA wordt versterkt tot hoge copy numbers. Ten eerste, 1 bacterie
kan snel delen en uiteindelijk veel identieke cel klonen produceren. Ten tweede, sommige
vectormoleculen kunnen in een bacteriele cel repliceren voor veel copy numbers te bereiken. Als ze
vreemd DNA sequenties gebonden hebben, zal dit ook versterkt worden in de cel.
Vectormoleculen
Om te repliceren in de cel, heeft de DNA molecule een geschikt origine van replicatie nodig, een DNA
sequentie dat de DNA replicatie zal initiëren. Voor het klonen in bacteriën worden typisch
extrachromosomale replicons gebruikt die onafhankelijk van het bacteriële chromosoom repliceren.
2 goede bronnen zijn plasmiden en bacteriofagen.
Het kloneringsvector (plasmide, bacteriofaag,..) moet eerst genetisch gemodificeerd worden zodat
we efficient een vreemd DNA er aan kunnen verbinden. Wanneer het klonen in bacteriën wordt
uitgevoerd, zal de vector bijvoorbeeld genetisch zijn gemodificeerd om een gen te bevatten dat
resistentie verleent tegen een antibioticum waarvoor de gastheercellen gevoelig zijn. Na
transformatie worden de cellen gekweekt op agar die het antibioticum bevat; niet-getransformeerde
cellen sterven af, maar getransformeerde cellen overleven.
,Plasmiden
Kleine circulaire DNA moleculen in bacteriën, bevatten meestal slechts enkele genen en worden in de
natuur aangetroffen. Worden verticaal van oudercel naar dochtercellen doorgegeven en komen voor
in supercoil. Wordt veel gebruikt als kloneringsvector en heeft een high copy number origine en een
antibioticumresistentie gen. In de plasmide zit een roigine, kloneringsplaats (GAATTC) en een
antibiotica resistentiegen.
Fysieke kloonscheiding
We moeten de cellen die verschillende DNA -fragmenten hebben opgenomen van elkaar scheiden.
Na transformatie van bacteriecellen worden, bijvoorbeeld, “portie” van het celmengsel over het
oppervlak van antibiotica bevattende agar in petrischalen verspreid (plateren). Succesvol
getransformeerde cellen zouden moeten groeien en zich vermenigvuldigen; als de
plateringsdichtheid optimaal is, vormen ze goed gescheiden celkolonies. Elke kolonie bestaat uit
identiek afstammende cellen (celklonen) die afkomstig zijn van een enkele getransformeerde cel en
dus bevatten alle celklonen dezelfde enkel vreemd DNA molecule. Een afzonderlijke, goed
gescheiden celkolonie kan vervolgens fysiek worden geplukt en worden gebruikt om de groei van een
grote cultuur van identieke cellen te starten die allemaal hetzelfde vreemde DNA-molecuul bevatten,
wat resulteert in een zeer grote amplificatie van een enkele interessante DNA-sequentie. Daarna kan
het gekloneerde vreemde DNA uit de bacteriecellen worden gezuiverd.
Recombinant DNA maken
Elk gewild DNA-fragment moet covalent worden verbonden
(geligeerd) door een DNA-ligase aan een vector-DNA-molecuul
om een recombinant-DNA te vormen dat vervolgens naar een
geschikte gastheercel wordt getransporteerd. Eerst moet het
gewilde DNA en het vector DNA worden voorbereid zodat ze
makkelijk kunnen worden verbonden en de recombinante
DNAs moeten van optimale grootte zijn. Om DNA in
bacteriecellen te klonen, moeten we normaal gesproken
relatief kleine DNA-fragmenten gebruiken. Wanneer DNA
wordt geïsoleerd uit de cellen van complexe organismen,
worden de immens lange nucleaire DNA-moleculen
gefragmenteerd door fysische afschuifkrachten om een
heterogene verzameling van nog vrij lange fragmenten met
heterogene uiteinden te geven. De lange fragmenten moeten
terug stukken van een veel kleinere, hanteerbare grootte
worden met meer uniforme eindsequenties om ligatie te
vergemakkelijken.
De cruciale doorbraak was het benutten van het vermogen van
restrictie-endonucleasen om het DNA op gedefinieerde
plaatsen te knippen. Als een resultaat zou het DNA kunnen
worden gereduceerd tot kleine goed gedefinieerde fragmenten
met uniforme eindsequenties die gemakkelijk kunnen worden
verbonden door een DNA-ligase om op vergelijkbare wijze
vectormoleculen te knippen.
, Restrictie endonucleasen:
Verdedigingssysteem van bacterie tegen bacteriofagen
- Knippen vreemd DNA dat bacterie binnenkomt (bacteriofaag DNA)
- Bacterie beschermt eigen DNA met overeenkomstige methylase
Naam afgeleid van het organisme:
- EcoRI Escherchia coli GAATTC
- BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC
Type II restrictie enzymen
- Specifieke herkenningssequentie
- Bijna altijd palindroomsequenties
- Produceren sticky of blunt eindjes
Herkenningsseq. (# bp) Gemiddelde lengte
4 256 (44)
6 4096 (46)
8 65536 (48)
Knippen en plakken: schaar is restrictie endonucleases of restrictieenzymes en komen uit bacterie.
Deze hebben een verdedigingssysteem tegen virussen. Heeft bepaalde herkenningssequentie.
Telkens als die enzymes de CAATTC zien knippen ze dit heel nauwkeurig. Maar knipt niet als het
gemetyleerd is. Als virus zijn DNA in het eigen DNA spuit is het niet gemetyleerd en wordt het
geknipt. DNA ligase plakt de sticky ends aan elkaar.
Visueel:
DNA technieken
- Kloneren van DNA
- Polymerase kettingreactie
o Gewone PCR
o QPCR
- Nucleïnezuurhybridisatie
o Blotting technieken (Southern, Northern)
o Microarrays
- DNA sequentiebepaling
o Sanger sequencing
o Next generation sequencing
3.1 DNA klonering en PCR
Klonering= maken van stukken DNA uit 2 verschillende DNA’s dus 1 van mens bijvoorbeeld en 1 van
een dier.
DNA klonering: fractioneren en zuiveren van DNA door cellen te transformeren met
recombinant DNA
Het kloneren van DNA is een manier van DNA sequenties reinigen. Grote hoeveelheden van DNA
sequenties kunnen zo gemaakt worden dat sequenties bestudeert kunnen worden of nuttig gebruikt
kunnen worden. De cellen die gebruikt worden zijn meestal bacteriën.
Eerst moeten we de cellen behandelen op een bepaalde manier om overdracht van DNA in de cellen
moeilijk te maken = transformatie.
Het te klonen DNA worden aan een vector-DNA-sequentie gebonden die zal helpen het te repliceren
in de gastheercel.
Door het samenvoegen van DNA en vectormoleculen krijg je kunstmatig recombinant DNA dat lineair
of circulair kan zijn, zoals bij het klonen van DNA in bacteriën. Het transformatieproces is selectief:
wanneer vreemd DNA in een cel komt, wordt meestal slechts een enkele DNA-molecule opgenomen
door een cel.
Amplificatie
Het bacterieel kloneringssysteem maakt het mogelijk om grote aantallen te krijgen van het
gekloneerd DNA. Het ingevoegde DNA wordt versterkt tot hoge copy numbers. Ten eerste, 1 bacterie
kan snel delen en uiteindelijk veel identieke cel klonen produceren. Ten tweede, sommige
vectormoleculen kunnen in een bacteriele cel repliceren voor veel copy numbers te bereiken. Als ze
vreemd DNA sequenties gebonden hebben, zal dit ook versterkt worden in de cel.
Vectormoleculen
Om te repliceren in de cel, heeft de DNA molecule een geschikt origine van replicatie nodig, een DNA
sequentie dat de DNA replicatie zal initiëren. Voor het klonen in bacteriën worden typisch
extrachromosomale replicons gebruikt die onafhankelijk van het bacteriële chromosoom repliceren.
2 goede bronnen zijn plasmiden en bacteriofagen.
Het kloneringsvector (plasmide, bacteriofaag,..) moet eerst genetisch gemodificeerd worden zodat
we efficient een vreemd DNA er aan kunnen verbinden. Wanneer het klonen in bacteriën wordt
uitgevoerd, zal de vector bijvoorbeeld genetisch zijn gemodificeerd om een gen te bevatten dat
resistentie verleent tegen een antibioticum waarvoor de gastheercellen gevoelig zijn. Na
transformatie worden de cellen gekweekt op agar die het antibioticum bevat; niet-getransformeerde
cellen sterven af, maar getransformeerde cellen overleven.
,Plasmiden
Kleine circulaire DNA moleculen in bacteriën, bevatten meestal slechts enkele genen en worden in de
natuur aangetroffen. Worden verticaal van oudercel naar dochtercellen doorgegeven en komen voor
in supercoil. Wordt veel gebruikt als kloneringsvector en heeft een high copy number origine en een
antibioticumresistentie gen. In de plasmide zit een roigine, kloneringsplaats (GAATTC) en een
antibiotica resistentiegen.
Fysieke kloonscheiding
We moeten de cellen die verschillende DNA -fragmenten hebben opgenomen van elkaar scheiden.
Na transformatie van bacteriecellen worden, bijvoorbeeld, “portie” van het celmengsel over het
oppervlak van antibiotica bevattende agar in petrischalen verspreid (plateren). Succesvol
getransformeerde cellen zouden moeten groeien en zich vermenigvuldigen; als de
plateringsdichtheid optimaal is, vormen ze goed gescheiden celkolonies. Elke kolonie bestaat uit
identiek afstammende cellen (celklonen) die afkomstig zijn van een enkele getransformeerde cel en
dus bevatten alle celklonen dezelfde enkel vreemd DNA molecule. Een afzonderlijke, goed
gescheiden celkolonie kan vervolgens fysiek worden geplukt en worden gebruikt om de groei van een
grote cultuur van identieke cellen te starten die allemaal hetzelfde vreemde DNA-molecuul bevatten,
wat resulteert in een zeer grote amplificatie van een enkele interessante DNA-sequentie. Daarna kan
het gekloneerde vreemde DNA uit de bacteriecellen worden gezuiverd.
Recombinant DNA maken
Elk gewild DNA-fragment moet covalent worden verbonden
(geligeerd) door een DNA-ligase aan een vector-DNA-molecuul
om een recombinant-DNA te vormen dat vervolgens naar een
geschikte gastheercel wordt getransporteerd. Eerst moet het
gewilde DNA en het vector DNA worden voorbereid zodat ze
makkelijk kunnen worden verbonden en de recombinante
DNAs moeten van optimale grootte zijn. Om DNA in
bacteriecellen te klonen, moeten we normaal gesproken
relatief kleine DNA-fragmenten gebruiken. Wanneer DNA
wordt geïsoleerd uit de cellen van complexe organismen,
worden de immens lange nucleaire DNA-moleculen
gefragmenteerd door fysische afschuifkrachten om een
heterogene verzameling van nog vrij lange fragmenten met
heterogene uiteinden te geven. De lange fragmenten moeten
terug stukken van een veel kleinere, hanteerbare grootte
worden met meer uniforme eindsequenties om ligatie te
vergemakkelijken.
De cruciale doorbraak was het benutten van het vermogen van
restrictie-endonucleasen om het DNA op gedefinieerde
plaatsen te knippen. Als een resultaat zou het DNA kunnen
worden gereduceerd tot kleine goed gedefinieerde fragmenten
met uniforme eindsequenties die gemakkelijk kunnen worden
verbonden door een DNA-ligase om op vergelijkbare wijze
vectormoleculen te knippen.
, Restrictie endonucleasen:
Verdedigingssysteem van bacterie tegen bacteriofagen
- Knippen vreemd DNA dat bacterie binnenkomt (bacteriofaag DNA)
- Bacterie beschermt eigen DNA met overeenkomstige methylase
Naam afgeleid van het organisme:
- EcoRI Escherchia coli GAATTC
- BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC
Type II restrictie enzymen
- Specifieke herkenningssequentie
- Bijna altijd palindroomsequenties
- Produceren sticky of blunt eindjes
Herkenningsseq. (# bp) Gemiddelde lengte
4 256 (44)
6 4096 (46)
8 65536 (48)
Knippen en plakken: schaar is restrictie endonucleases of restrictieenzymes en komen uit bacterie.
Deze hebben een verdedigingssysteem tegen virussen. Heeft bepaalde herkenningssequentie.
Telkens als die enzymes de CAATTC zien knippen ze dit heel nauwkeurig. Maar knipt niet als het
gemetyleerd is. Als virus zijn DNA in het eigen DNA spuit is het niet gemetyleerd en wordt het
geknipt. DNA ligase plakt de sticky ends aan elkaar.
Visueel:
