Samenvatting enzymkinetiek
1. Eénsubstraatsreacties
Steady-state = de fase van een enzymatische reactie waarin de concentratie
enzym-substraatcomplex (ES) stabiel blijft
➔ De snelheid van de vorming van het ES-complex is gelijk aan de snelheid van de afbraak ervan
➔ Bv. het aantal werknemers in een bedrijf is steady-state als het aantal arbeiders dat jaarlijks
ontslagen wordt, spontaan weggaat en op pensioen gaat gelijk is aan het aantal nieuw
aangeworven werknemers
➔ Als een enzym gemengd wordt met een overmaat substraat dan is er een korte periode, de
presteady-state, waarin de concentraties van de tussenproducten (ES) opgebouwd wordt tot
het steady-state niveau
➔
➔ Equilibrium = evenwicht
➔ A (absorbance) = E (extinctie)
De Michaëlis-Menten vergelijking:
➔ Maximal velocity = maximale snelheid (vmax)
➔ KM = de Michaëlis-Menten constante
➔ Voor de meeste enzymen verandert de
katalysesnelheid met de substraatconcentratie
volgens de MM-curve
➔ Bij een constante [E] + een lage [S] is de snelheid
rechtevenredig met de [S]
→ Bij een hoge [S] is de reactiesnelheid
onafhankelijk van de [S]
➔ Het substraat (S) bindt op het enzym (E) met vorming van een enzym-substraatcomplex (ES)
→ Dit gebeurt met een snelheidsconstante k1
→ Het ES-complex kan verdwijnen door:
Dissociatie met een snelheidsconstante k2
EN/OF
Door reactie waarbij een reactieproduct (P) gevormd wordt met een
snelheidsconstante k3
, De michaëlis-Menten vergelijking:
→ [Et] = totale enzymconcentratie
Als [S] heel hoog is, zijn alle enzymen verzadigd
→ [Et] ≈ [ES]
→ v = k3 . [Et] = vmax ---> DUS:
De Michaëlis-Menten constante (KM):
▪ = Een maat voor de affiniteit van een enzym voor zijn substraat
→ Een kleine KM betekent sterke binding met substraat of een grote affiniteit
→ Een grote KM betekent zwakke binding met substraat of een kleine affiniteit
▪ Geeft de [S] weer waarbij de reactiesnelheid de helft van de maximale snelheid (vmax) bereikt
→ M.a.w. de helft van de actieve centra is gebonden met substraat
→
▪ Voor de meeste enzymen ligt de KM-waarde tussen 10-1 en 10-6M
▪ Is afhankelijk van:
Het enzym → de KM-waarde van enzymen kan sterk variëren
De aard van het substraat
De pH
De temperatuur
De ionsterkte
De maximale snelheid (vmax):
▪ = De reactiesnelheid waarbij alle actieve centra verzadigd zijn met substraat
▪ Als de concentratie aan actieve centra gekend is, kan uit vmax het turnover number berekend
worden
→ Het turnover number (k3 of kcat) = het maximum aantal substraatmoleculen dat per actief
centrum (dus per enzym) en per tijdseenheid omgezet
wordt in product
= een maat voor het katalytisch vermogen van het enzym
voor een welbepaald substraat
→ De turnover numbers van de meeste enzymen voor hun natuurlijke substraten liggen
tussen 1 tot 104 per seconde
, → Hoe het turnover number (k3) bepalen:
➢ Bepaal voor een reeks [E] de reactiesnelheden (v) in mol/L.min
→ Deze reactiesnelheden zet je vervolgens grafisch uit t.o.v. de overeenkomstige
enzymconcentraties (in U/L)
→ Als je werkt bij een hoge [S] is v gelijk aan vmax
➢ De richtingscoëfficiënt van de rechte = k3 (in mol/min.U)
➢ Om k3 om te zetten in s-1 moet je rekening houden met de specifieke activiteit (SA)
van het enzym (het aantal Units per mg eiwit)
Vaak wordt de Michaëlis-Menten vergelijking getransformeerd naar een lineaire vorm om zo vrij snel
de kinetische parameters (KM en vmax) te kunnen bepalen + eventuele afwijkingen van de Michaëlis-
Menten kinetiek te kunnen opsporen
➔ Er zijn verschillende transformaties mogelijk:
1. De Lineweaver-Burk transformatie
→
➔ Slope = richtingscoëfficiënt (rico)
➔
→ Vergelijking van de rechte: y = a.x + b
1 1
---> met y = en x = [S]
v
2. De Hanes-Woolf transformatie
→
➔
➔ Is statistisch de beste methode
want mooiere spreiding van punten
2. Inhibitie
Inhibitie = het verlagen van de reactiesnelheid van een chemische reactie
➔ Enzymen kunnen zowel irreversibel als reversibel geïnactiveerd/geïnhibeerd worden
→ Irreversibele inhibitie ontstaat door hitte of chemische reacties
→ Reversibele inhibitie ontstaat door een niet-covalente binding aan een inhibitor
, ➔ Mechanismen:
De binding met de actieve site blokkeren
De activiteit van de actieve site verlagen
Chemische reacties → bij covalente bindingen is inhibitie moeilijk of niet mogelijk
Omgevingsfactoren veranderen → bv. pH, temperatuur, …
Reversibele inhibitie:
= Een vorm van remming waarbij de binding tussen het enzym en de inhibitor tijdelijk en
omkeerbaar is
Is van groot belang:
➢ Als controle mechanisme in biologische systemen
➢ Voor inzicht te verkrijgen in het werkingsmechanisme van het enzym
➢ In de farmaceutische industrie om de affiniteit van de verschillende inhibitoren voor
een bepaald enzym te kennen
Wordt gekenmerkt door een evenwichtsinstelling tussen enzym en inhibitor
→ Enzym en inhibitor binden en ontbinden constant
→ M.a.w. de oorspronkelijke toestand van het enzym kan worden hersteld als men de
inhibitor verwijdert, wat leidt tot een evenwichtstoestand
Er zijn verschillende vormen binnen reversibele inhibitie:
1) Competitieve inhibitie
➢ De inhibitor bindt op dezelfde plaats als het substraat
→ De reactiesnelheid daalt doordat er minder substraat
op het enzym kan binden
➢ Inhibitor en substraat lijken chemisch sterk op elkaar
➢ KM wordt groter
→ De [S] moet hoger zijn om dezelfde snelheid te behouden
→ De inhibitie kan opgeheven worden door bij een zeer hoge [S] te
werken ( [I] << [S] )
→ Bij een zeer hoge inhibitorconcentratie kan de reactie volledig stilgelegd
worden ( [I] >> [S] )
➢
, ➢ Hoe verandert de Lineweaver-Burk en Hanes curve met inhibitor?
→ De Lineweaver-Burk curve:
➔ Beide rechten snijden in hetzelfde
punt op de 1/v-as
→ De Hanes-Woolf curve:
➔ Beide rechten zijn evenwijdig aan
elkaar
→ De rico’s zijn gelijk!
2) Niet-competitieve inhibitie
➢ De inhibitor bindt op een andere plaats dan het substraat (= allosterische
inhibitie)
→ De inhibitor bindt dus NIET op het actief centrum!
➢ Binding van de inhibitor aan het enzym leidt tot structurele veranderingen van
het enzym
→ Dit zorgt voor vermindering/verlies van de functionaliteit
➢ De inhibitor lijkt (meestal) niet op het substraat
→ Er is dus ook geen competitie met het substraat
➢ De katalyse wordt vaak volledig tegengehouden door binding van de inhibitor
(= simple non-competitief)
➢ KM blijft onveranderd → binding van de inhibitor op het enzym beïnvloedt
de binding van het substraat niet
➢ vmax daalt, ook bij hoge [S] → inhibitie kan niet ongedaan worden gemaakt
door het [S] te verhogen
1. Eénsubstraatsreacties
Steady-state = de fase van een enzymatische reactie waarin de concentratie
enzym-substraatcomplex (ES) stabiel blijft
➔ De snelheid van de vorming van het ES-complex is gelijk aan de snelheid van de afbraak ervan
➔ Bv. het aantal werknemers in een bedrijf is steady-state als het aantal arbeiders dat jaarlijks
ontslagen wordt, spontaan weggaat en op pensioen gaat gelijk is aan het aantal nieuw
aangeworven werknemers
➔ Als een enzym gemengd wordt met een overmaat substraat dan is er een korte periode, de
presteady-state, waarin de concentraties van de tussenproducten (ES) opgebouwd wordt tot
het steady-state niveau
➔
➔ Equilibrium = evenwicht
➔ A (absorbance) = E (extinctie)
De Michaëlis-Menten vergelijking:
➔ Maximal velocity = maximale snelheid (vmax)
➔ KM = de Michaëlis-Menten constante
➔ Voor de meeste enzymen verandert de
katalysesnelheid met de substraatconcentratie
volgens de MM-curve
➔ Bij een constante [E] + een lage [S] is de snelheid
rechtevenredig met de [S]
→ Bij een hoge [S] is de reactiesnelheid
onafhankelijk van de [S]
➔ Het substraat (S) bindt op het enzym (E) met vorming van een enzym-substraatcomplex (ES)
→ Dit gebeurt met een snelheidsconstante k1
→ Het ES-complex kan verdwijnen door:
Dissociatie met een snelheidsconstante k2
EN/OF
Door reactie waarbij een reactieproduct (P) gevormd wordt met een
snelheidsconstante k3
, De michaëlis-Menten vergelijking:
→ [Et] = totale enzymconcentratie
Als [S] heel hoog is, zijn alle enzymen verzadigd
→ [Et] ≈ [ES]
→ v = k3 . [Et] = vmax ---> DUS:
De Michaëlis-Menten constante (KM):
▪ = Een maat voor de affiniteit van een enzym voor zijn substraat
→ Een kleine KM betekent sterke binding met substraat of een grote affiniteit
→ Een grote KM betekent zwakke binding met substraat of een kleine affiniteit
▪ Geeft de [S] weer waarbij de reactiesnelheid de helft van de maximale snelheid (vmax) bereikt
→ M.a.w. de helft van de actieve centra is gebonden met substraat
→
▪ Voor de meeste enzymen ligt de KM-waarde tussen 10-1 en 10-6M
▪ Is afhankelijk van:
Het enzym → de KM-waarde van enzymen kan sterk variëren
De aard van het substraat
De pH
De temperatuur
De ionsterkte
De maximale snelheid (vmax):
▪ = De reactiesnelheid waarbij alle actieve centra verzadigd zijn met substraat
▪ Als de concentratie aan actieve centra gekend is, kan uit vmax het turnover number berekend
worden
→ Het turnover number (k3 of kcat) = het maximum aantal substraatmoleculen dat per actief
centrum (dus per enzym) en per tijdseenheid omgezet
wordt in product
= een maat voor het katalytisch vermogen van het enzym
voor een welbepaald substraat
→ De turnover numbers van de meeste enzymen voor hun natuurlijke substraten liggen
tussen 1 tot 104 per seconde
, → Hoe het turnover number (k3) bepalen:
➢ Bepaal voor een reeks [E] de reactiesnelheden (v) in mol/L.min
→ Deze reactiesnelheden zet je vervolgens grafisch uit t.o.v. de overeenkomstige
enzymconcentraties (in U/L)
→ Als je werkt bij een hoge [S] is v gelijk aan vmax
➢ De richtingscoëfficiënt van de rechte = k3 (in mol/min.U)
➢ Om k3 om te zetten in s-1 moet je rekening houden met de specifieke activiteit (SA)
van het enzym (het aantal Units per mg eiwit)
Vaak wordt de Michaëlis-Menten vergelijking getransformeerd naar een lineaire vorm om zo vrij snel
de kinetische parameters (KM en vmax) te kunnen bepalen + eventuele afwijkingen van de Michaëlis-
Menten kinetiek te kunnen opsporen
➔ Er zijn verschillende transformaties mogelijk:
1. De Lineweaver-Burk transformatie
→
➔ Slope = richtingscoëfficiënt (rico)
➔
→ Vergelijking van de rechte: y = a.x + b
1 1
---> met y = en x = [S]
v
2. De Hanes-Woolf transformatie
→
➔
➔ Is statistisch de beste methode
want mooiere spreiding van punten
2. Inhibitie
Inhibitie = het verlagen van de reactiesnelheid van een chemische reactie
➔ Enzymen kunnen zowel irreversibel als reversibel geïnactiveerd/geïnhibeerd worden
→ Irreversibele inhibitie ontstaat door hitte of chemische reacties
→ Reversibele inhibitie ontstaat door een niet-covalente binding aan een inhibitor
, ➔ Mechanismen:
De binding met de actieve site blokkeren
De activiteit van de actieve site verlagen
Chemische reacties → bij covalente bindingen is inhibitie moeilijk of niet mogelijk
Omgevingsfactoren veranderen → bv. pH, temperatuur, …
Reversibele inhibitie:
= Een vorm van remming waarbij de binding tussen het enzym en de inhibitor tijdelijk en
omkeerbaar is
Is van groot belang:
➢ Als controle mechanisme in biologische systemen
➢ Voor inzicht te verkrijgen in het werkingsmechanisme van het enzym
➢ In de farmaceutische industrie om de affiniteit van de verschillende inhibitoren voor
een bepaald enzym te kennen
Wordt gekenmerkt door een evenwichtsinstelling tussen enzym en inhibitor
→ Enzym en inhibitor binden en ontbinden constant
→ M.a.w. de oorspronkelijke toestand van het enzym kan worden hersteld als men de
inhibitor verwijdert, wat leidt tot een evenwichtstoestand
Er zijn verschillende vormen binnen reversibele inhibitie:
1) Competitieve inhibitie
➢ De inhibitor bindt op dezelfde plaats als het substraat
→ De reactiesnelheid daalt doordat er minder substraat
op het enzym kan binden
➢ Inhibitor en substraat lijken chemisch sterk op elkaar
➢ KM wordt groter
→ De [S] moet hoger zijn om dezelfde snelheid te behouden
→ De inhibitie kan opgeheven worden door bij een zeer hoge [S] te
werken ( [I] << [S] )
→ Bij een zeer hoge inhibitorconcentratie kan de reactie volledig stilgelegd
worden ( [I] >> [S] )
➢
, ➢ Hoe verandert de Lineweaver-Burk en Hanes curve met inhibitor?
→ De Lineweaver-Burk curve:
➔ Beide rechten snijden in hetzelfde
punt op de 1/v-as
→ De Hanes-Woolf curve:
➔ Beide rechten zijn evenwijdig aan
elkaar
→ De rico’s zijn gelijk!
2) Niet-competitieve inhibitie
➢ De inhibitor bindt op een andere plaats dan het substraat (= allosterische
inhibitie)
→ De inhibitor bindt dus NIET op het actief centrum!
➢ Binding van de inhibitor aan het enzym leidt tot structurele veranderingen van
het enzym
→ Dit zorgt voor vermindering/verlies van de functionaliteit
➢ De inhibitor lijkt (meestal) niet op het substraat
→ Er is dus ook geen competitie met het substraat
➢ De katalyse wordt vaak volledig tegengehouden door binding van de inhibitor
(= simple non-competitief)
➢ KM blijft onveranderd → binding van de inhibitor op het enzym beïnvloedt
de binding van het substraat niet
➢ vmax daalt, ook bij hoge [S] → inhibitie kan niet ongedaan worden gemaakt
door het [S] te verhogen
