Samenvatting: Bacteriologie 1
Hoofdstuk 2: Microscopie
2.1 Onderdeel van een microscoop
Lenzen (Oculair: 10x en objectieven)
Verstelbare objecttafel
Macro- en microschroef
Condensor met diafragma
Lichtbron
2.2 Soorten
Helderveldmicroscoop: Nat preparaat met kleurstof of uitstrijkpreparaat met gramkleuring (1000x)
Donkerveldmicroscoop: Ongekleurd preparaat voor bewegelijkheid en moeilijk kleurbare kiemen
(Contrast door speciale condensor – Vaak voor spirillen)
Fasecontrastmicroscoop: Bewegelijkheid en innerlijke structuur bekijken door speciale objectief
waardoor men betere contrast verkrijgt.
Fluorescentiemicroscoop: Fixeren van preparaat met calcofluor of fluorescent gelabeld antiserum
Bekijken onder UV-microscoop
2.3 Vers onderzoek
= Rechtstreeks onderzoek van het klinisch staal
Nat preparaat (fysiologisch water of kleurstof die toxisch is voor cel): Vorm en bewegelijkheid
Men kan hierdoor ook leukocyten en epitheelcellen van elkaar onderscheiden.
2.4 De gramkleuring
Kristalviolet kleurt de cellen paars doordat het binnen in de peptidoglycaanlaag binnendringt en
zo in het cytoplasma terecht komt.
Lugol vormt met kristalviolet een moeilijk oplosbaar complex in ethanol
Men ontkleurt door het toevoegen van ethanol.
Gram-negatief: Kleurstof wordt uitgewassen
Gram-positief: Kleurstof blijft achter door dikke
laag peptidoglycaanlaag maar deze laag krimpt
samen door ethanol en minder doorlaatbaar
wordt.
Safranine is een contrastkleurstof die nodig is voor de
tegenkleuring voor gram negatieve cellen
1
,2.5 De Ziehl-Neelsen-kleuring
= Kleuring om zuurvaste bacteriën op te sporen
Bijvoorbeeld: Mycobacterium tuberculosis, Nocardia
Materiaal dikker aanbrengen
Fushine: De cellen kleuren rood
Lugol: Complexvorming met fushine
Ontkleuren: Zuur ontkleurt alle cellen behalve diegene met zuurvaste celwand (blijven rood)
Tegenkleuren met methyleenblauw: niet-zuurvaste cellen worden blauw gekleurd
2.6 De auraminekleuring
= Alternatieve snellere en vlottere zuurvaste kleuring
UV-microscoop: Gele bacillen door fluorescentie op donkerblauwe achtergrond
Eventueel herkleuring met Kinyounmethode (?)
Zelfde methode als Ziehl-Neelsen maar met auramine als 1ste stap en geen lugol stap.
2.7 Immunofluorescentiekleuring
Gelabelde antilichamen met fluorofoor die specifiek binden op antigenen
Was stap: Niet gebonden antistoffen te verwijderen
UV-microscoop: Geel tot geelgroen micro-organisme
BAL-vocht: Legionella pneumophila, Pneumocystis carinii
2.8 Flagellakleuring
= Identificatiekenmerk die gebruikt wordt bij niet-fermenteerders
2.9 Giemsakleuring
Opsporen parasieten in het bloed: Plasmodium, Leishmania en Trypanosoma
Dikdruppel of bloeduitstrijkje
2.10 Calcofluorkleuring
= kleuring van fungi
Pneumocystis carinii wordt via deze techniek opgespoord in BAL-vocht
Men bekijkt deze onder de UV-microscoop
2.11 Opdrachten
a) Welke eigenschap van het preparaat gaat er een beetje op achteruit bij het maken van een
uitstrijkje, vergeleken met een ongekleurd vers preparaat?
b) Waarom moet men bij de 100 X-vergroting immersie olie gebruiken?
c) Waarom kleuren de grampositieve bacteriën paars met de gramkleuring en de gramnegatieve
roze?
d) Noem een staal waarop men logischerwijs een zuurvaste kleuring op zou kunnen uitvoeren.
e) Waarom gebruikt men in de zuurvaste kleuring een zure methyleenblauw oplossing?
2
, Hoofdstuk 3: Kweekmethoden
3.1 Inleiding
Doel = identificatie van een micro-organismen
Staal enten op isolatiebodem om een reincultuur te verkrijgen
Bestanddelen van een voedingsbodem:
• Organische bestanddelen zoals suikers, afbraakproducten van EW en DNA
• Buffers
• Groeifactoren
• %agar gehalte
3.2 Kweekmethoden
3.2.1 Vaste en vloeibare voedingsbodems
a) Bloedagar (BA)
Basisbodem: Zowel groei als fungi mogelijk
5 % bloed toegevoegd na sterilisatie en afkoeling
α-hemolyse: Er is een partiële omzetting van Hb tot metHb, waardoor er een groene kleur ontstaat.
(Viridans streptokokken, Streptococcus pneumoniae)
ß-hemolyse: Er is een volledige lyse van de rbc rond de kolonies: we zien een heldere zone.
(Streptococcus pyogenes, ook bij sommige Staphylococcusaureus-stammen)
γ-hemolyse: Er is geen hemolyse. De bacterie beschikt niet over hemolysines. (E. coli)
b) Brain Heart Infusion (BHI)
Algemene voedingsbodem
Vast (met agar) of vloeibaar (bouillon)
c) Chocolade-agar
= Voedingsbodem met gelyseerd bloed
Fastidious organismen: Organismen die extra groeifactoren vereisen voor hun groei
Haemophilus influenzae en Neisseria gonorrhoeae
Na steriliseren en afkoelen wordt bloed toegevoegd en nadien nogmaals verhit -> Lyse
X-factor (hemin) en V-factor (NAD+) komen vrij en zorgen voor bruine kleur
d) Universele vaste/vloeibare voedingsbodems
• Tryptic Soy Broth
• Thioglycollaat bouillon
Aangewend wanneer er weinig staal aanwezig is om deze op te kweken.
Nadien moet deze worden overgeënt om een afzonderlijke reincultuur te bekomen.
3
Hoofdstuk 2: Microscopie
2.1 Onderdeel van een microscoop
Lenzen (Oculair: 10x en objectieven)
Verstelbare objecttafel
Macro- en microschroef
Condensor met diafragma
Lichtbron
2.2 Soorten
Helderveldmicroscoop: Nat preparaat met kleurstof of uitstrijkpreparaat met gramkleuring (1000x)
Donkerveldmicroscoop: Ongekleurd preparaat voor bewegelijkheid en moeilijk kleurbare kiemen
(Contrast door speciale condensor – Vaak voor spirillen)
Fasecontrastmicroscoop: Bewegelijkheid en innerlijke structuur bekijken door speciale objectief
waardoor men betere contrast verkrijgt.
Fluorescentiemicroscoop: Fixeren van preparaat met calcofluor of fluorescent gelabeld antiserum
Bekijken onder UV-microscoop
2.3 Vers onderzoek
= Rechtstreeks onderzoek van het klinisch staal
Nat preparaat (fysiologisch water of kleurstof die toxisch is voor cel): Vorm en bewegelijkheid
Men kan hierdoor ook leukocyten en epitheelcellen van elkaar onderscheiden.
2.4 De gramkleuring
Kristalviolet kleurt de cellen paars doordat het binnen in de peptidoglycaanlaag binnendringt en
zo in het cytoplasma terecht komt.
Lugol vormt met kristalviolet een moeilijk oplosbaar complex in ethanol
Men ontkleurt door het toevoegen van ethanol.
Gram-negatief: Kleurstof wordt uitgewassen
Gram-positief: Kleurstof blijft achter door dikke
laag peptidoglycaanlaag maar deze laag krimpt
samen door ethanol en minder doorlaatbaar
wordt.
Safranine is een contrastkleurstof die nodig is voor de
tegenkleuring voor gram negatieve cellen
1
,2.5 De Ziehl-Neelsen-kleuring
= Kleuring om zuurvaste bacteriën op te sporen
Bijvoorbeeld: Mycobacterium tuberculosis, Nocardia
Materiaal dikker aanbrengen
Fushine: De cellen kleuren rood
Lugol: Complexvorming met fushine
Ontkleuren: Zuur ontkleurt alle cellen behalve diegene met zuurvaste celwand (blijven rood)
Tegenkleuren met methyleenblauw: niet-zuurvaste cellen worden blauw gekleurd
2.6 De auraminekleuring
= Alternatieve snellere en vlottere zuurvaste kleuring
UV-microscoop: Gele bacillen door fluorescentie op donkerblauwe achtergrond
Eventueel herkleuring met Kinyounmethode (?)
Zelfde methode als Ziehl-Neelsen maar met auramine als 1ste stap en geen lugol stap.
2.7 Immunofluorescentiekleuring
Gelabelde antilichamen met fluorofoor die specifiek binden op antigenen
Was stap: Niet gebonden antistoffen te verwijderen
UV-microscoop: Geel tot geelgroen micro-organisme
BAL-vocht: Legionella pneumophila, Pneumocystis carinii
2.8 Flagellakleuring
= Identificatiekenmerk die gebruikt wordt bij niet-fermenteerders
2.9 Giemsakleuring
Opsporen parasieten in het bloed: Plasmodium, Leishmania en Trypanosoma
Dikdruppel of bloeduitstrijkje
2.10 Calcofluorkleuring
= kleuring van fungi
Pneumocystis carinii wordt via deze techniek opgespoord in BAL-vocht
Men bekijkt deze onder de UV-microscoop
2.11 Opdrachten
a) Welke eigenschap van het preparaat gaat er een beetje op achteruit bij het maken van een
uitstrijkje, vergeleken met een ongekleurd vers preparaat?
b) Waarom moet men bij de 100 X-vergroting immersie olie gebruiken?
c) Waarom kleuren de grampositieve bacteriën paars met de gramkleuring en de gramnegatieve
roze?
d) Noem een staal waarop men logischerwijs een zuurvaste kleuring op zou kunnen uitvoeren.
e) Waarom gebruikt men in de zuurvaste kleuring een zure methyleenblauw oplossing?
2
, Hoofdstuk 3: Kweekmethoden
3.1 Inleiding
Doel = identificatie van een micro-organismen
Staal enten op isolatiebodem om een reincultuur te verkrijgen
Bestanddelen van een voedingsbodem:
• Organische bestanddelen zoals suikers, afbraakproducten van EW en DNA
• Buffers
• Groeifactoren
• %agar gehalte
3.2 Kweekmethoden
3.2.1 Vaste en vloeibare voedingsbodems
a) Bloedagar (BA)
Basisbodem: Zowel groei als fungi mogelijk
5 % bloed toegevoegd na sterilisatie en afkoeling
α-hemolyse: Er is een partiële omzetting van Hb tot metHb, waardoor er een groene kleur ontstaat.
(Viridans streptokokken, Streptococcus pneumoniae)
ß-hemolyse: Er is een volledige lyse van de rbc rond de kolonies: we zien een heldere zone.
(Streptococcus pyogenes, ook bij sommige Staphylococcusaureus-stammen)
γ-hemolyse: Er is geen hemolyse. De bacterie beschikt niet over hemolysines. (E. coli)
b) Brain Heart Infusion (BHI)
Algemene voedingsbodem
Vast (met agar) of vloeibaar (bouillon)
c) Chocolade-agar
= Voedingsbodem met gelyseerd bloed
Fastidious organismen: Organismen die extra groeifactoren vereisen voor hun groei
Haemophilus influenzae en Neisseria gonorrhoeae
Na steriliseren en afkoelen wordt bloed toegevoegd en nadien nogmaals verhit -> Lyse
X-factor (hemin) en V-factor (NAD+) komen vrij en zorgen voor bruine kleur
d) Universele vaste/vloeibare voedingsbodems
• Tryptic Soy Broth
• Thioglycollaat bouillon
Aangewend wanneer er weinig staal aanwezig is om deze op te kweken.
Nadien moet deze worden overgeënt om een afzonderlijke reincultuur te bekomen.
3
