Cel II: Cytologie
HF1: Prepareren en observeren van cellen en
weefsels
Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor de LM of EM.
Probleem? Weinig licht/elektronen doorlatend en weinig contrast in biologisch
materiaal.
1660: eerste microscoop gebruikt door Robert Hooke
1.1.Lichtmicroscopie
Resolutie: 200 nm, wordt mede bepaalt door objectief en golflengte van zichtbaar
licht. (=de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden
weergegeven)
Celculturen komen op dekglaasjes te liggen (dikker materiaal wordt versneden en
ingebed in paraffine).
1.1.1. Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop
Meeste preparaten worden in LM bekeken met doorvallend wit licht
3 lenssystemen: de condensor, objectie en de oculairen
̶> condensor bundelt het doorvallende licht op het preparaat
̶> objectief kijkt met zeer korte werkafstand naar het preparaat (vergroot beeld)
̶> oculair zal beeld na vergroten op retina
̶> heeft een verstelbare tafel
̶> prisma dient om de lichtweg te buigen, voor comfortabele
zitpositie
Verschillende soorten:
1. Klaar-veld microscoop
2. Fase-contrast microscoop
3. Fluorescentie microscoop
1
,1.1.2. Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen
Fase-contrastmicroscopie: op basis van faseverschuiving van licht
- Uitvinding va Zernike (nobelprijs 1953)
- Kleine faseveranderingen die ontstaan door brekingsverschillen in het preparaat
- Toegepast op ongekleurde preparaten (gekweekte levende cellen of vriescoupes)
Differentieel interferentie-contrastmicroscopie: op basis van neg/pos
interferentie van gepolariseerd licht (DIC)
- Vereist gespecialiseerde microscoop met prismaʼs en interferentiefilter
- Heel duur, geeft 3D beelden van levende cellen
Digitale microscopie: computerverwerking van beelden met ultragevoelige
videocameraʼs
Donkervelmicroscopie: bij kleine objecten, zoals bacteriën en organellen
Fluorescentiemicroscopie: Voor life cell imaging
Principes van lichtmicroscopietechnieken:
Verhoging van het contrast in lichtmicroscopie kan op 2 manieren:
1. Histologische kleuring ̶> reduceert de amplitude van bepaalde golflengtes ̶>
kleurvorming
2. Ongekleurd weefselpreparaat, verschillende optische dichtheden ̶> afwijkende
brekeingsindex ̶> faseverschuiving van opvallend licht ̶> door interferentie naar
ZW-beeld omgezet
1.2. Voorbereiden preparaat
1.2.1. Fixeren
= Bewaren van weefsels met behoud van hun oorspronkelijke structuur door het
denatureren van eiwitten, eenmaal uit vivo situatie ̶> afbreekenzymen actief
Chemische fixatieven: Formol (LM), glutaraldehyde/ OSO4 (EM) (cross-linken), alcohol
(neerslaan OF Invriezen (snel diagnose)
̶> oppassen voor artefacten (= veranderingen die tijdens fixatie in een weefsel
ontstaan en afwijken van de in vivo structuur (vb: kraakbeencellen en mastcellen)
2
,1.2.2. Inbedden
= Het gefixeerde materiaal omwikkelen en doordringen met inbedmiddelen (niet bij
koude fixatie)
Inbedmiddel: doordringt de substantie, wordt hard en is daarna snijdbaar in dunne
coupes, is meestal hydrofoob
vb: Paraffine (LM), hars, plastics..
MAAR: weefsel bevat veel water ̶> ontwateren met reeks alcoholbaden
Daarna ʻclearingʼ mvb tolueen, dat mengt met alcohol en inbedmiddel
1.2.3. Snijden
= Door de hardheid van het inbedmiddel kan je het weefsel nu snijden in dunne
coupes/plakken
Paraffine ̶> 5-10 μm (doorlaatbaar voor licht) (55 )
hars, plastics ̶> 70 nm (doorlaatbaar voor elektronen) (60-65 )
Alles wordt gesneden met een microtoom (LM: stalen mes, EM: diamanten of glazen
mes)
Daarna worden de coupes op een glazen draagglaasje gelegd (LM) of een metalen
rooster (EM, grid)
1.2.4. Kleuren (LM observatie)
Kleurstoffen zijn waterige oplossingen (moet gecleared zijn)
̶> door wit licht hierdoor te sturen krijg je kleuring
Routinekleuring: Haematoxyline - Eosine kleuring (H/E kleuring)
- Haematoxyline: is zelf basisch (+), zal reageren met zure bestanddelen (kern)
BLAUW (vb: DNA en RNA)
- Eosine: is zelf zuur (-), zal aankleuren met basische bestanddelen (cytoplasma)
ROZE/ORANJE (vb: eiwitten, proteïnen)
- Kleuren gebeurt bij pH=6
3
, Uitzonderingen:
- Koolhydraten en suikers:
- Slecht kleurbaar met HE kleuring, lossen op in waterige fixatief
- Bij fixatie stof toevoegen die koolhydraten neerslaat (dan kleurbaar met
Haematyxyline) = metachromasie
- (vb: kraakbeen en mastcellen)
- Vetten:
- Oplosbaar in alcohol, dus niet kleurbaar met HE ̶> lege zones
- EM: OsO4 gebruiken, grote affiniteit voor vetzuren, worden dus
bewaard en gecontrasteerd
1.3. Specifieke kleurtechnieken
Indefferente kleurstoffen: kleuren vetten aan
Immunohistochemsiche kleuring: kleuren
specifieke delen aan op basis van antigen/
antilichaam werking. Op antilichaam wordt
keursotf, fluorescerende label of colloidaal goud
voorzien.
Enzymkleuring: om activiteit van enzymen aan te tonen, enzym specifiek substraat,
waarneembare neerslag vorming
Autoradiografie: om metabolische activiteit aan te tonen, radioactief gemerkte
precursoren ingebouwd, contact met fotografische emulsie
4
HF1: Prepareren en observeren van cellen en
weefsels
Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor de LM of EM.
Probleem? Weinig licht/elektronen doorlatend en weinig contrast in biologisch
materiaal.
1660: eerste microscoop gebruikt door Robert Hooke
1.1.Lichtmicroscopie
Resolutie: 200 nm, wordt mede bepaalt door objectief en golflengte van zichtbaar
licht. (=de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden
weergegeven)
Celculturen komen op dekglaasjes te liggen (dikker materiaal wordt versneden en
ingebed in paraffine).
1.1.1. Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop
Meeste preparaten worden in LM bekeken met doorvallend wit licht
3 lenssystemen: de condensor, objectie en de oculairen
̶> condensor bundelt het doorvallende licht op het preparaat
̶> objectief kijkt met zeer korte werkafstand naar het preparaat (vergroot beeld)
̶> oculair zal beeld na vergroten op retina
̶> heeft een verstelbare tafel
̶> prisma dient om de lichtweg te buigen, voor comfortabele
zitpositie
Verschillende soorten:
1. Klaar-veld microscoop
2. Fase-contrast microscoop
3. Fluorescentie microscoop
1
,1.1.2. Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen
Fase-contrastmicroscopie: op basis van faseverschuiving van licht
- Uitvinding va Zernike (nobelprijs 1953)
- Kleine faseveranderingen die ontstaan door brekingsverschillen in het preparaat
- Toegepast op ongekleurde preparaten (gekweekte levende cellen of vriescoupes)
Differentieel interferentie-contrastmicroscopie: op basis van neg/pos
interferentie van gepolariseerd licht (DIC)
- Vereist gespecialiseerde microscoop met prismaʼs en interferentiefilter
- Heel duur, geeft 3D beelden van levende cellen
Digitale microscopie: computerverwerking van beelden met ultragevoelige
videocameraʼs
Donkervelmicroscopie: bij kleine objecten, zoals bacteriën en organellen
Fluorescentiemicroscopie: Voor life cell imaging
Principes van lichtmicroscopietechnieken:
Verhoging van het contrast in lichtmicroscopie kan op 2 manieren:
1. Histologische kleuring ̶> reduceert de amplitude van bepaalde golflengtes ̶>
kleurvorming
2. Ongekleurd weefselpreparaat, verschillende optische dichtheden ̶> afwijkende
brekeingsindex ̶> faseverschuiving van opvallend licht ̶> door interferentie naar
ZW-beeld omgezet
1.2. Voorbereiden preparaat
1.2.1. Fixeren
= Bewaren van weefsels met behoud van hun oorspronkelijke structuur door het
denatureren van eiwitten, eenmaal uit vivo situatie ̶> afbreekenzymen actief
Chemische fixatieven: Formol (LM), glutaraldehyde/ OSO4 (EM) (cross-linken), alcohol
(neerslaan OF Invriezen (snel diagnose)
̶> oppassen voor artefacten (= veranderingen die tijdens fixatie in een weefsel
ontstaan en afwijken van de in vivo structuur (vb: kraakbeencellen en mastcellen)
2
,1.2.2. Inbedden
= Het gefixeerde materiaal omwikkelen en doordringen met inbedmiddelen (niet bij
koude fixatie)
Inbedmiddel: doordringt de substantie, wordt hard en is daarna snijdbaar in dunne
coupes, is meestal hydrofoob
vb: Paraffine (LM), hars, plastics..
MAAR: weefsel bevat veel water ̶> ontwateren met reeks alcoholbaden
Daarna ʻclearingʼ mvb tolueen, dat mengt met alcohol en inbedmiddel
1.2.3. Snijden
= Door de hardheid van het inbedmiddel kan je het weefsel nu snijden in dunne
coupes/plakken
Paraffine ̶> 5-10 μm (doorlaatbaar voor licht) (55 )
hars, plastics ̶> 70 nm (doorlaatbaar voor elektronen) (60-65 )
Alles wordt gesneden met een microtoom (LM: stalen mes, EM: diamanten of glazen
mes)
Daarna worden de coupes op een glazen draagglaasje gelegd (LM) of een metalen
rooster (EM, grid)
1.2.4. Kleuren (LM observatie)
Kleurstoffen zijn waterige oplossingen (moet gecleared zijn)
̶> door wit licht hierdoor te sturen krijg je kleuring
Routinekleuring: Haematoxyline - Eosine kleuring (H/E kleuring)
- Haematoxyline: is zelf basisch (+), zal reageren met zure bestanddelen (kern)
BLAUW (vb: DNA en RNA)
- Eosine: is zelf zuur (-), zal aankleuren met basische bestanddelen (cytoplasma)
ROZE/ORANJE (vb: eiwitten, proteïnen)
- Kleuren gebeurt bij pH=6
3
, Uitzonderingen:
- Koolhydraten en suikers:
- Slecht kleurbaar met HE kleuring, lossen op in waterige fixatief
- Bij fixatie stof toevoegen die koolhydraten neerslaat (dan kleurbaar met
Haematyxyline) = metachromasie
- (vb: kraakbeen en mastcellen)
- Vetten:
- Oplosbaar in alcohol, dus niet kleurbaar met HE ̶> lege zones
- EM: OsO4 gebruiken, grote affiniteit voor vetzuren, worden dus
bewaard en gecontrasteerd
1.3. Specifieke kleurtechnieken
Indefferente kleurstoffen: kleuren vetten aan
Immunohistochemsiche kleuring: kleuren
specifieke delen aan op basis van antigen/
antilichaam werking. Op antilichaam wordt
keursotf, fluorescerende label of colloidaal goud
voorzien.
Enzymkleuring: om activiteit van enzymen aan te tonen, enzym specifiek substraat,
waarneembare neerslag vorming
Autoradiografie: om metabolische activiteit aan te tonen, radioactief gemerkte
precursoren ingebouwd, contact met fotografische emulsie
4
