Hoofdstuk 5: Analyse van biomoleculen in de praktijk
Morfologische analyse
Lichtmicroscopie
Zuiverheid en integriteit van kernen en mitochondriën
Resolutie 0,2 µm -> golflengte 200nm anders kan je structuren niet van elkaar scheiden -> punten die
dichter bij elkaar liggen dan de golflengte kan je niet van elkaar onderscheiden
Polarisatie lichtmicroscopie: detectie optisch actieve substanties in cel
Object in lichtweg tussen 2 polarisatiefilters, licht wordt gestuurd door polarisator vlak, staal
tussensteken dat licht verandert -> polarisatievlak gaat veranderen
Fasecontrast lichtmicroscopie: microscopische analyse levende cellen door beeldcontract te
verhogen en gebruik makend van interferentie van lichtgolven
Een ‘faseplaatje’ tussen de condensor en het specimen zorgt ervoor dat twee lichtbundels
met een onderling faseverschil door het transparante preparaat vallen
Elektronenmicroscopie
Resolutie: 1nm, vergroting 200.000
Gebruik elektronen ipv licht
Scanning elektronenmicroscopie: informatie over celoppervlak
Staal bijkomend coaten met koolstoflaag -> elektronen gaan afketsen
Transmissie elektronenmicroscopie: informatie over structuur
Biochemische analyse
Analyse van aminozuur- en eiwitoplossingen
Kwantificatie aminozuren
Kwantificatie eiwitten
Karakteristieken eiwitten
o Primaire structuur van eiwitten
o Secundaire en tertiaire structuur van eiwitten
Analyse van nucleotide- en nucleïnezuuroplossingen
Analyse van carbohydraatoplossingen
Analyse van lipiden
Kwantificatie van aminozuren: colorimetrie
Ninhydrine reactie: vorming van blauwe kleur door reactie van ninhydrine met molecules
met een vrije aminogroep
Dehydratie-, decarboxylatie- en hydrolysereacties -> vorming amine dat condenseert met 2 e
ninhydrinemolecule -> vorming Ruhemann’s violet
Bepaling met Sanger-reagens: AZ + 1-fluor-2,4-dinitrobenzeen -> dinitrofenolaat: gele kleur
Bepaling met Dansylchloride: dansylchloride + N-terminale aminogroepen -> sterk
fluorescerend product -> zeer gevoelig
Kwantificatie van eiwitten
Fluorescentie meest gevoelig voor detecteerbaarheid
, Colorimetrie:
Biureetmethode: complexvorming Cu-atoom met het centrale stikstofatoom van 4
biureetmoleculen → purper gekleurd complex
Ureum wordt opgewarmd -> biureet -> kopercomplex
Reactie gaat door met stoffen welke twee NH 2-CO (bv biureet), NH2-CH2- en NH2-CS
of gelijke groepen verbonden door een C- of N-atoom bevatten, dus ook met
peptiden en eiwitten
Absorptie gemeten bij 540nm tov BSA
Methode van Lowry: zelfde principe als biureetmethode, maar verbetert
Eerste stap biureetreactie met koper -> vorming tetradentaatkopercomplex
Toevoeging fosfomolybdeen-fosfowolfraamreagens -> evenredige reductie ->
blauwgroene kleur (neerslag vorming of gekleurd reagens)
Bicinchoninezuurmethode: variant: conversie Cu 2+ tot Cu1+ -> koper gedetecteerd
door reactie met BSA -> vorming purper Cu 1+ - BCA complex
Methode van Bradford: eiwitten binden kleurstoffen -> eigenschappen eiwit
veranderen -> verandering in absorptiespectrum
CBB bindt dmv sulfaatgroep aan geprotoneerde aminozuren
Voordeel: makkelijk te bereiden kleurreagens dat snel ontwikkelt en stabiel is
UV-absorptie:
Meeste eiwitten absorberen UV-licht
Absorptie door tyrosine, tryptofaan, fenylalanine en disulfidebruggen van cysteïne -> door
dubbele bindingen in ring
Onderlinge verhoudingen AZ verschillen per eiwit
Absorbantie eiwitten bij 280nm -> corrigeren door extra meting bij 235 nm
Acceptable pure protein: absorbantie bij 260/ absorbantie bij 280 = 0,6
Acceptable “pure” nucleic acid: absorbantie bij 260/absorbantie bij 280 = 1,8 - 2
Fluorescentie
Op basis van interne groepen: tryptofaan en tyrosine
Op basis van externe groepen: zijn al fluorescent of krijgen fluorescente
eigenschappen door te binden
o Fluorescamine: zelf niet fluorescent, vormt fluorescent product na reactie
met primair amine
o O-ftaldialdehyde: zelf niet fluorescent, vormt fluorescent product na reactie
met primair amine in aanwezigheid van reducerend agens -> gevoeligheid
kan worden verhoogd door zure hydrolyse waardoor reactie met alfa-NH2
groep van vrijgestelde AZ wordt geïnduceerd
Fysische methoden
Nefelometrie
Refractometrie
Turbidimetrie
Specificiteit zeer beperkt, wordt vooral toegepast voor analyse van stalen waarvan
de concentratie van contaminerende polymeren relatief laag is tov het te analyseren
biopolymeer
Karakterisatie van eiwitten
Primaire structuur: refereert naar lineair aantal en rangorde van aanwezige aminozuren
Edman reactie/degradatie: bepaling partiële sequenties eiwitten. Gelabelde
polypeptideketen stapsgewijs afbreken en identificeren
Morfologische analyse
Lichtmicroscopie
Zuiverheid en integriteit van kernen en mitochondriën
Resolutie 0,2 µm -> golflengte 200nm anders kan je structuren niet van elkaar scheiden -> punten die
dichter bij elkaar liggen dan de golflengte kan je niet van elkaar onderscheiden
Polarisatie lichtmicroscopie: detectie optisch actieve substanties in cel
Object in lichtweg tussen 2 polarisatiefilters, licht wordt gestuurd door polarisator vlak, staal
tussensteken dat licht verandert -> polarisatievlak gaat veranderen
Fasecontrast lichtmicroscopie: microscopische analyse levende cellen door beeldcontract te
verhogen en gebruik makend van interferentie van lichtgolven
Een ‘faseplaatje’ tussen de condensor en het specimen zorgt ervoor dat twee lichtbundels
met een onderling faseverschil door het transparante preparaat vallen
Elektronenmicroscopie
Resolutie: 1nm, vergroting 200.000
Gebruik elektronen ipv licht
Scanning elektronenmicroscopie: informatie over celoppervlak
Staal bijkomend coaten met koolstoflaag -> elektronen gaan afketsen
Transmissie elektronenmicroscopie: informatie over structuur
Biochemische analyse
Analyse van aminozuur- en eiwitoplossingen
Kwantificatie aminozuren
Kwantificatie eiwitten
Karakteristieken eiwitten
o Primaire structuur van eiwitten
o Secundaire en tertiaire structuur van eiwitten
Analyse van nucleotide- en nucleïnezuuroplossingen
Analyse van carbohydraatoplossingen
Analyse van lipiden
Kwantificatie van aminozuren: colorimetrie
Ninhydrine reactie: vorming van blauwe kleur door reactie van ninhydrine met molecules
met een vrije aminogroep
Dehydratie-, decarboxylatie- en hydrolysereacties -> vorming amine dat condenseert met 2 e
ninhydrinemolecule -> vorming Ruhemann’s violet
Bepaling met Sanger-reagens: AZ + 1-fluor-2,4-dinitrobenzeen -> dinitrofenolaat: gele kleur
Bepaling met Dansylchloride: dansylchloride + N-terminale aminogroepen -> sterk
fluorescerend product -> zeer gevoelig
Kwantificatie van eiwitten
Fluorescentie meest gevoelig voor detecteerbaarheid
, Colorimetrie:
Biureetmethode: complexvorming Cu-atoom met het centrale stikstofatoom van 4
biureetmoleculen → purper gekleurd complex
Ureum wordt opgewarmd -> biureet -> kopercomplex
Reactie gaat door met stoffen welke twee NH 2-CO (bv biureet), NH2-CH2- en NH2-CS
of gelijke groepen verbonden door een C- of N-atoom bevatten, dus ook met
peptiden en eiwitten
Absorptie gemeten bij 540nm tov BSA
Methode van Lowry: zelfde principe als biureetmethode, maar verbetert
Eerste stap biureetreactie met koper -> vorming tetradentaatkopercomplex
Toevoeging fosfomolybdeen-fosfowolfraamreagens -> evenredige reductie ->
blauwgroene kleur (neerslag vorming of gekleurd reagens)
Bicinchoninezuurmethode: variant: conversie Cu 2+ tot Cu1+ -> koper gedetecteerd
door reactie met BSA -> vorming purper Cu 1+ - BCA complex
Methode van Bradford: eiwitten binden kleurstoffen -> eigenschappen eiwit
veranderen -> verandering in absorptiespectrum
CBB bindt dmv sulfaatgroep aan geprotoneerde aminozuren
Voordeel: makkelijk te bereiden kleurreagens dat snel ontwikkelt en stabiel is
UV-absorptie:
Meeste eiwitten absorberen UV-licht
Absorptie door tyrosine, tryptofaan, fenylalanine en disulfidebruggen van cysteïne -> door
dubbele bindingen in ring
Onderlinge verhoudingen AZ verschillen per eiwit
Absorbantie eiwitten bij 280nm -> corrigeren door extra meting bij 235 nm
Acceptable pure protein: absorbantie bij 260/ absorbantie bij 280 = 0,6
Acceptable “pure” nucleic acid: absorbantie bij 260/absorbantie bij 280 = 1,8 - 2
Fluorescentie
Op basis van interne groepen: tryptofaan en tyrosine
Op basis van externe groepen: zijn al fluorescent of krijgen fluorescente
eigenschappen door te binden
o Fluorescamine: zelf niet fluorescent, vormt fluorescent product na reactie
met primair amine
o O-ftaldialdehyde: zelf niet fluorescent, vormt fluorescent product na reactie
met primair amine in aanwezigheid van reducerend agens -> gevoeligheid
kan worden verhoogd door zure hydrolyse waardoor reactie met alfa-NH2
groep van vrijgestelde AZ wordt geïnduceerd
Fysische methoden
Nefelometrie
Refractometrie
Turbidimetrie
Specificiteit zeer beperkt, wordt vooral toegepast voor analyse van stalen waarvan
de concentratie van contaminerende polymeren relatief laag is tov het te analyseren
biopolymeer
Karakterisatie van eiwitten
Primaire structuur: refereert naar lineair aantal en rangorde van aanwezige aminozuren
Edman reactie/degradatie: bepaling partiële sequenties eiwitten. Gelabelde
polypeptideketen stapsgewijs afbreken en identificeren
