ECB H10 Modern Recombinant DNA Technology
Het manipuleren en analyseren van DNA-moleculen
Met de hedendaagse technieken is het mogelijk om met grote precisie en snelheid DNA aan
te passen en de functie van bepaalde genen te bepalen. Hiervoor moeten we echter wel met
geïsoleerde manipuleerbare genen werken. Dit is lastig, omdat genen geen op zichzelf
staande moleculen zijn, maar onderdeel zijn van een groter molecuul. Om een enkele gen
van een genoom te scheiden moet DNA dus in stukken geknipt worden. Dit kan door middel
van restrictie enzymen. Deze enzymen knippen dubbelstrengs DNA op bepaalde sequenties
en kunnen daarom gebruikt worden om een reproduceerbare set van specifieke DNA-
fragmenten van elk genoom te produceren.
Restrictie nucleasen
Restrictie enzymen zijn enzymen die DNA op specifieke plaatsen (nucleotide sequenties)
knippen. Deze enzymen beperken de transfer van DNA tussen stammen van bacteriën en
worden daarom ook wel restrictie nucleasen genoemd. Verschillende bacteriële soorten
produceren verschillende restrictie nucleasen waarbij elk bij een specifieke nucleotide
sequentie knipt. De reden dat restrictie nucleasen handig zijn in het laboratorium is dat elk
enzym een bepaald DNA-molecuul op dezelfde plekken knipt.
De grootte van de resulterende fragmenten hangt af van de target sequenties van de
restrictie nucleasen. Het enzym HaeIII knipt bij een sequentie van vier nucleotide paren. Dus
een sequentie bij dit enzym zal verwacht worden bij elke 256 nucleotide paren (1 op 44).
De target sequenties zijn vaak palindromen. Een palindroom is een sequentie die
symmetrisch is in een bepaald punt. Hier worden beide strengen van de dubbele helix op
specifieke punten in de target sequentie
geknipt. Sommige enzymen, bijvoorbeeld
HaeIII, knippen recht door de dubbele helix
heen. Maar wanneer bijvoorbeeld EcoRI en
HindIII door de dubbele helix knippen zullen
er uitstekende uiteindes ontstaan. Dit
worden ook wel sticky ends genoemd. Deze
vorm van knippen zorgt ervoor dat de
geknipte DNA moleculen weer kunnen
samenplakken door complementaire
baseparing.
Gel elektroforese
Nadat een groter DNA molecuul geknipt is in kleinere stukken met een restrictie nuclease,
kunnen de DNA fragmenten gescheiden worden op basis van grootte. Daarna wordt een
mengsel van de DNA fragmenten in agarose of polyacrylamide gel gedaan. Wanneer er een
spanning over de gel wordt gezet zullen de negatief geladen DNA fragmenten migreren naar
de positieve elektrode. Hierbij zullen grotere fragmenten minder snel migreren, omdat ze
meer belemmerd worden door de gelmatrix. Enkele uren later zullen de DNA-fragmenten
verspreid zijn over de gel. Er is een ladder van discrete banden gevormd, elk bestaande uit
een collectie van DNA-moleculen van identieke lengte. Om het gewenste DNA-fragment te
isoleren wordt het stukje eruit uitgesneden en vervolgens het DNA geëxtraheerd.
,Visualisatie van banden in gel
De gescheiden DNA-banden op gel zijn niet
zichtbaar. Om deze banden te zien moet het DNA
gelabeld of gekleurd worden. Een gevoelige manier is
om de gel bloot te stellen aan een verfje dat
fluoresceert onder ultraviolet licht wanneer gebonden
aan DNA.
Een gevoeligere manier is om de DNA-moleculen te
labelen met een radio-isotoop voordat ze worden
gescheiden door elektroforese. 32 P wordt bijvoorbeeld
vaak gebruikt en kan worden opgenomen in de
fosfaten van DNA. Omdat de uitgezonden β-deeltjes
van 32 P stralingsgevoelige deeltjes in een
fotografische film kunnen activeren, zal een film
geplaatst bovenop de gel de posities van alle DNA-
banden laten zien.
Hybridisatie
Deze twee genoemde manieren zullen alle banden op
de gel laten zien, maar het laat niet zien welke
banden DNA van interesse bevatten. Dit kan wel
worden gedaan door hybridisatie.
Bij normale condities zijn de twee strengen van de DNA dubbele helix gebonden door
waterstofbruggen tussen de complementaire baseparen. Echter deze zijn relatief zwak, want
niet-covalente bindingen kunnen makkelijk gebroken worden. Dit wordt ook wel DNA
denaturatie genoemd. Hierbij worden niet de covalente bindingen tussen de nucleotiden in
elke streng gebroken. De makkelijkste manier om DNA denaturatie te krijgen is om DNA te
verhitten bij 90°C. Wanneer de temperatuur langzaam wordt verlaagd, zullen de
complementaire strengen samen komen om de dubbele helix weer te vormen. Dit wordt ook
wel hybridisatie genoemd en wordt gedreven door de reformatie van de waterstofbruggen
tussen complementaire baseparen.
Hybridisatie met de capaciteit om een dubbele helix te vormen met enkelstrengs moleculen
of complementaire sequenties geeft een sterke en gevoelige techniek om specifieke
nucleotide sequenties in DNA en RNA te detecteren.
, Om een bepaalde sequentie te vinden is er een enkelstrengs DNA probe nodig met de
complementaire nucleotiden. Omdat de nucleotide sequenties van veel genomen bekend
zijn, is het makkelijk om zo’n probe te ontwerpen. Deze kan daarna worden gesynthetiseerd
in het laboratorium. Ook zijn deze probes vaak gelabeld met een fluorescent of radioactief
label om de detectie van de nucleotide sequentie waaraan ze binden te faciliteren.
Eenmaal de juiste probe is gevonden kan het gebruikt worden om een sequentie van
interesse te vinden in DNA fragmenten die zijn gescheiden op een agarose gel. In dit geval
worden de fragmenten eerst overgebracht op een papier en daarna blootgesteld aan de
gelabelde probe. Het zoeken naar complementair DNA met een probe wordt ook wel
Southern blotting (gel-transfer hybridisatie genoemd).
DNA kloneren in bacteriën
De term DNA-klonering refereert naar de productie van veel identieke kopieën van een DNA
sequentie. Het is deze amplificatie die het mogelijk maakt om een bepaald segment van
DNA, vaak een gen van interesse, te scheiden van de rest van het genoom in een cel.
DNA-klonering begint met genoomfragmentatie en productie van recombinant DNA
Hele genomen zijn te groot en onhandelbaar in het laboratorium. Daarom is de eerste stap in
het kloneringsproces van elk gen om het genoom in kleinere stukken te breken. Bacteriële
restrictie nucleasen worden gebruikt om lange DNA-moleculen te knippen in fragmenten.
Deze fragmenten kunnen dan samengevoegd worden door DNA ligase te gebruiken. Dit is
een enzym die de DNA-strengen, waarvan beide complementaire strengen gebroken zijn,
weer aan elkaar kan maken. Door DNA ligase te gebruiken kunnen twee DNA-stukken aan
elkaar worden geplakt, waardoor recombinante DNA-moleculen worden geproduceerd die
Het manipuleren en analyseren van DNA-moleculen
Met de hedendaagse technieken is het mogelijk om met grote precisie en snelheid DNA aan
te passen en de functie van bepaalde genen te bepalen. Hiervoor moeten we echter wel met
geïsoleerde manipuleerbare genen werken. Dit is lastig, omdat genen geen op zichzelf
staande moleculen zijn, maar onderdeel zijn van een groter molecuul. Om een enkele gen
van een genoom te scheiden moet DNA dus in stukken geknipt worden. Dit kan door middel
van restrictie enzymen. Deze enzymen knippen dubbelstrengs DNA op bepaalde sequenties
en kunnen daarom gebruikt worden om een reproduceerbare set van specifieke DNA-
fragmenten van elk genoom te produceren.
Restrictie nucleasen
Restrictie enzymen zijn enzymen die DNA op specifieke plaatsen (nucleotide sequenties)
knippen. Deze enzymen beperken de transfer van DNA tussen stammen van bacteriën en
worden daarom ook wel restrictie nucleasen genoemd. Verschillende bacteriële soorten
produceren verschillende restrictie nucleasen waarbij elk bij een specifieke nucleotide
sequentie knipt. De reden dat restrictie nucleasen handig zijn in het laboratorium is dat elk
enzym een bepaald DNA-molecuul op dezelfde plekken knipt.
De grootte van de resulterende fragmenten hangt af van de target sequenties van de
restrictie nucleasen. Het enzym HaeIII knipt bij een sequentie van vier nucleotide paren. Dus
een sequentie bij dit enzym zal verwacht worden bij elke 256 nucleotide paren (1 op 44).
De target sequenties zijn vaak palindromen. Een palindroom is een sequentie die
symmetrisch is in een bepaald punt. Hier worden beide strengen van de dubbele helix op
specifieke punten in de target sequentie
geknipt. Sommige enzymen, bijvoorbeeld
HaeIII, knippen recht door de dubbele helix
heen. Maar wanneer bijvoorbeeld EcoRI en
HindIII door de dubbele helix knippen zullen
er uitstekende uiteindes ontstaan. Dit
worden ook wel sticky ends genoemd. Deze
vorm van knippen zorgt ervoor dat de
geknipte DNA moleculen weer kunnen
samenplakken door complementaire
baseparing.
Gel elektroforese
Nadat een groter DNA molecuul geknipt is in kleinere stukken met een restrictie nuclease,
kunnen de DNA fragmenten gescheiden worden op basis van grootte. Daarna wordt een
mengsel van de DNA fragmenten in agarose of polyacrylamide gel gedaan. Wanneer er een
spanning over de gel wordt gezet zullen de negatief geladen DNA fragmenten migreren naar
de positieve elektrode. Hierbij zullen grotere fragmenten minder snel migreren, omdat ze
meer belemmerd worden door de gelmatrix. Enkele uren later zullen de DNA-fragmenten
verspreid zijn over de gel. Er is een ladder van discrete banden gevormd, elk bestaande uit
een collectie van DNA-moleculen van identieke lengte. Om het gewenste DNA-fragment te
isoleren wordt het stukje eruit uitgesneden en vervolgens het DNA geëxtraheerd.
,Visualisatie van banden in gel
De gescheiden DNA-banden op gel zijn niet
zichtbaar. Om deze banden te zien moet het DNA
gelabeld of gekleurd worden. Een gevoelige manier is
om de gel bloot te stellen aan een verfje dat
fluoresceert onder ultraviolet licht wanneer gebonden
aan DNA.
Een gevoeligere manier is om de DNA-moleculen te
labelen met een radio-isotoop voordat ze worden
gescheiden door elektroforese. 32 P wordt bijvoorbeeld
vaak gebruikt en kan worden opgenomen in de
fosfaten van DNA. Omdat de uitgezonden β-deeltjes
van 32 P stralingsgevoelige deeltjes in een
fotografische film kunnen activeren, zal een film
geplaatst bovenop de gel de posities van alle DNA-
banden laten zien.
Hybridisatie
Deze twee genoemde manieren zullen alle banden op
de gel laten zien, maar het laat niet zien welke
banden DNA van interesse bevatten. Dit kan wel
worden gedaan door hybridisatie.
Bij normale condities zijn de twee strengen van de DNA dubbele helix gebonden door
waterstofbruggen tussen de complementaire baseparen. Echter deze zijn relatief zwak, want
niet-covalente bindingen kunnen makkelijk gebroken worden. Dit wordt ook wel DNA
denaturatie genoemd. Hierbij worden niet de covalente bindingen tussen de nucleotiden in
elke streng gebroken. De makkelijkste manier om DNA denaturatie te krijgen is om DNA te
verhitten bij 90°C. Wanneer de temperatuur langzaam wordt verlaagd, zullen de
complementaire strengen samen komen om de dubbele helix weer te vormen. Dit wordt ook
wel hybridisatie genoemd en wordt gedreven door de reformatie van de waterstofbruggen
tussen complementaire baseparen.
Hybridisatie met de capaciteit om een dubbele helix te vormen met enkelstrengs moleculen
of complementaire sequenties geeft een sterke en gevoelige techniek om specifieke
nucleotide sequenties in DNA en RNA te detecteren.
, Om een bepaalde sequentie te vinden is er een enkelstrengs DNA probe nodig met de
complementaire nucleotiden. Omdat de nucleotide sequenties van veel genomen bekend
zijn, is het makkelijk om zo’n probe te ontwerpen. Deze kan daarna worden gesynthetiseerd
in het laboratorium. Ook zijn deze probes vaak gelabeld met een fluorescent of radioactief
label om de detectie van de nucleotide sequentie waaraan ze binden te faciliteren.
Eenmaal de juiste probe is gevonden kan het gebruikt worden om een sequentie van
interesse te vinden in DNA fragmenten die zijn gescheiden op een agarose gel. In dit geval
worden de fragmenten eerst overgebracht op een papier en daarna blootgesteld aan de
gelabelde probe. Het zoeken naar complementair DNA met een probe wordt ook wel
Southern blotting (gel-transfer hybridisatie genoemd).
DNA kloneren in bacteriën
De term DNA-klonering refereert naar de productie van veel identieke kopieën van een DNA
sequentie. Het is deze amplificatie die het mogelijk maakt om een bepaald segment van
DNA, vaak een gen van interesse, te scheiden van de rest van het genoom in een cel.
DNA-klonering begint met genoomfragmentatie en productie van recombinant DNA
Hele genomen zijn te groot en onhandelbaar in het laboratorium. Daarom is de eerste stap in
het kloneringsproces van elk gen om het genoom in kleinere stukken te breken. Bacteriële
restrictie nucleasen worden gebruikt om lange DNA-moleculen te knippen in fragmenten.
Deze fragmenten kunnen dan samengevoegd worden door DNA ligase te gebruiken. Dit is
een enzym die de DNA-strengen, waarvan beide complementaire strengen gebroken zijn,
weer aan elkaar kan maken. Door DNA ligase te gebruiken kunnen twee DNA-stukken aan
elkaar worden geplakt, waardoor recombinante DNA-moleculen worden geproduceerd die
