Overzicht Methoden 3
H2-DNA
DNA analyse stappen (Methoden 1!):
1. Extraheren
a. Staal
b. Lyseren=cellen afbreken zodat DNA vrijkomt
i. Bv. vriezen en ontdooien, mechanische en liquide homogenisatie, sonicatie en
buffer (zoals enzymes die RNA of eiwitten afbreken)
c. Isoleren
i. Bv. organische solventen, geconcentreerd zout en kolomchromatografie (DNA
bindt selectief aan matrix→ elutie= zet DNA vrij)
d. Oplossen in bepaalde vloeistof daarbij concentreren
2. Kwantificeren→ weten hoeveel DNA je hebt
a. Spectrofotometrie→ absorptie van licht door DNA oplossing
b. Spectrofluorimetrie→ fluorescentie vrijgezet na binden van moleculen aan DNA
c. Elektroforese→ scheiding van DNA op basis van grootte→ DNA van neg. naar pos.
pool→ kortere DNA fragmenten migreren sneller→ visualiseren via fluorescentie
3. Concentreren
a. Alcoholprecipitatie→ concentreren en opzuiveren
b. Concentrators→ centrifuge
c. Speedvac→ verdamping
4. Amplificeren
a. PCR
i. Denaturatie=de twee strengen van DNA losmaken van elkaar/DNA openen
ii. Annealing/hybridisatie=primer binden aan DNA
iii. Extensie/elongatie
iv. New template DNA→ start cyclus over
DNA karakteriseren (Methoden 3!):
5. Sequencing= volgorde DNA aflezen
a. 1ste generation= 1 sequentie per keer met amplificatie
i. Sanger→ gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of
PCR→ Door ddNTP’s vele fragmenten met verschillende lengtes→ Analyse
via elektroforese→ fluorescente label op ddNTP’s dus weten waarop een
fragment eindigt→ Visualisatie in elektroferogram→ kwaliteitscontrole met
Phred score
1. Voordeel: mutatie detectie
2. Nadeel: moeite met herhalingen→ lezen langs twee kanten
3. Toepassing: Human Genome Project
b. 2nd generation= meerdere korte sequenties tegelijk met amplificatie
i. 4 stappen:
1. Aanmaak DNA library= verzameling van templates die je wilt gaan
sequencen
a. Input DNA kwaliteitscontrole
b. Random fragmentatie
c. End repair
, i. Blunt ends maken=beide strands gelijke afmeting
ii. 5’ uiteinde fosforyleren om adaptor te ligeren
iii. Eventueel 3’ taq-polymerase= A aan uiteinde hangen
zodat adaptor makkelijker ligeert
d. Adapters aanhechten
e. Alternatief: Tagmentatie= fragmentatie en adapters
aanhechten in één keer
f. Size selection→ agarose gel-elektroforese of magnetische
beads
g. Kwaliteitscontrole→ capillaire elektroferose
2. Klonale in vitro amplificatie
a. Emulsie PCR→ 1 bead in 1 druppel water gescheiden door
olie→ on bead PCR
b. Solid-phase bridge amplification→ DNA bindt random aan
een primer op het plaatje→ buigt tot het de complementaire
primer tegenkomt→ start polymerase
c. Solid phase template walking ‘wildfire’→ Oppervlak met
oligo’s complementair aan adaptoren→ Fragmenten laten
binden→Partiële denaturatie waardoor vrije uiteinden
‘wandelen’ lokaal amplificatie
d. Rolling circle amplification→ DNA fragment en adaptoren in
cirkel→ amplificatie en hybridiseren op plaatje
3. Sequencing
a. Sequencing-by-synthesis met reversible chain-terminators→
Ingebouwd van 1 terminal nucleotide (ddNTP)→gelabeled
met fluophore→ lees kleur→ kan beide afgooien→
opnieuw→ leest één base af
b. Sequencing-by-synthesis met een single nucleotide=
pyrosequencing→ Voeg één nucleotide toe→ kan twee
dingen meten (pyrofosfaat&proton)→pyrofosfaat komt vrij
en door omzetting van ATP→ activeert luciferase→
lichtflits→ vier nucleotide apart inbrengen
c. Ion-semiconductor sequencing→ Nucleotide wordt
toegevoegd→ proton komt vrij H+→ lading meten door
stroom meten→ stroomverandering→ aparte nucleotiden
d. Sequencing by ligation→ Ligase ipv polymerase→
Template+gebonden primer→ mengsel van oligonucleotiden
met elke een kleur → bepaald oligonucleotiden bindt op basis
van complementariteit→ Weet de eerste twee basen→ knipt
fluorescente groep +laatste 3 basen→ opnieuw
i. Voordeel: hoge accuraatheid→ geen last van
homopolymeren
ii. Nadeel: korte sequenties
4. Data analyse
ii. Platforms
1. 454/ Roche Genome Sequencer FLX (historisch)
a. Gebaseerd op: emulsion-based cloning en PCR en
pyrophosphate based sequencing
b. Voordeel: lange sequenties
c. Nadeel: fouten bij homopolymeren en indels en kostprijs te
hoog tov competitie
, d. Data analyse: flowgram→ aantal fotonen per flow tellen, in
elke flow wordt maar één dNTP aangeleverd, aantal
herhalingen van die base bepaald op basis van
drempelwaarden
e. Toepassing: genoom sequentie
2. ABI-SOLID platform (historisch)
a. Gebaseerd op: emulsie PCR en sequencing by hybridization
and ligation
b. Voordeel: hoge accuraatheid→ geen problemen met
homopolymeren→ handig naar kijken mutaties
c. Nadeel: korte sequenties→ moeilijk de novo seq. en traag,
3. Illumina
a. Gebaseerd op: bridge amplification en fluorescent reversible
chain termination sequencing
b. Voordeel: lage kostprijs, hoge throughput en accuraatheid→
weinig problemen met homopolymeren
c. Nadeel: korte sequenties
d. Toepassing:
i. Verspreiding van mensen/evolueert vanuit origine
ii. Mutaties oncologie
iii. Genoom van mammoet seq.
iv. Covid seq.
v. Gepersonaliseerde geneeskunde
vi. WES, WGS, targeted sequencing
4. Ion torrent
a. Gebaseerd op: emulsie PCR en ion semiconductor sequencing
b. Voordeel:
i. Snel
ii. Geen gemodificeerde nucleotiden
iii. Real time aflezing
iv. Geen enzymatische tussenstappen
v. Lage kostprijs per reactie en toestel
vi. Flexibel
vii. Vele toepassingen: amplicons, viraal DNA…
c. Nadeel:
i. Fouten bij homopolymeers
ii. Relatief korte sequenties
iii. Beperkte capaciteit (per run)
iii. Voordeel 2nd gen. seq.→ snelle en goedkope manier individuele genomen
seq. en weinig DNA template nodig
iv. Nadeel→ korte sequenties en soms lage accuraatheid
c. 3rd generation=1 DNA molecuul sequencen ZONDER amplificatie
i. Platforms
1. Single Molecule Real Time (SMRT) platform (PacBio)
a. Kleine putjes→ per putje één polymerase→ kan DNA streng
vastpakken met een primer en dan synthese→ Wanneer een
nucleotide wordt ingebouwd, wordt pyrofosfaat samen met de
fluorescente groep vrijgezet→ licht gemeten dicht bij de
onderkant van de put
, b. Accuraatheid verhoogd door hairpin→ Uiteinde hairpin vast
ligeren→ circulair gesequenced→ blijven sequencen
(meerder keren dezelfde fragment)
c. Voordeel:
i. Lange sequenties
ii. Geen amplificatie
iii. Hoge accuraatheid
iv. Lage cost per read
d. Toepassing: familiale vorm van epilepsie
2. Nanopore sequencing
a. Membraan waar heel klein poriën in zitten→ met motor eiwit
enkelstreng DNA door de porien duwen→ omdat er normaal
ionen doorheen gaan, verstopt de nucleotide de weg→ dit laat
de stroom dalen→ elke nucleotide verschillende stroom
b. Leaderhairpin zodat beide strengen kunnen worden
gesequenced→ hogere accuraatheid
c. Voordeel: lange sequenties
d. Nadeel: makkelijk fouten door kleine verschillen in stroom→
oplossing: Stratos Genomics (Roche) → elke nucleotide in
orginele template wordt geëxpandeerd (X-NTP’s)→ verschil
stroom groter
e. Toepassing: seq. covid, vele genomen seq. voor bijv.
kankergenomics, complexere stukjes van human genome seq.
voor Whole Genome Project
ii. Voordeel 3rd gen. seq.→ lange sequenties en geen amplificatie (→ geeft bias
want sommige stukken makkelijker geamplificeerd)
iii. Nadeel→ single pass aflezen van molecule heeft hoge error rate
d. Epigenetica sequentiebepaling
i. Epigenetica= modificaties aan basen die de genexpressie regelen→ nieuwe
uitdaging
ii. Belangrijkste chemische modificatie in mens DNA methylatie
5methylcytosine (5mC) in CpG
iii. Methodes:
1. Bisulfiet-conversie= gouden standaard
a. Bisulfiet converteert niet-gemethyleerde C naar U (in PCR→
T), gemethyleerde C blijft behouden
b. Resolutie is single base en kan >28miljoen CpGs meten
c. Voordeel: kan elke CpG afzonderlijk bepalen en leent zich tot
next-gen. seq.
d. Nadeel:
i. Hogere kosten
ii. Hogere DNA input
iii. DNA gedegradeerd
iv. Sterke chemische reactie kan DNA beschadigen
2. Restrictie enzyme
a. Methylatie-gevoelige restrictie enzymes klieven de restrictie-
site
b. Resolutie is single base en kan ongv. 2miljoen CpGs meten
c. Voordeel: hoge sensitiviteit en lagere kosten
d. Nadeel: beperkt to regio’s met restrictie-site
H2-DNA
DNA analyse stappen (Methoden 1!):
1. Extraheren
a. Staal
b. Lyseren=cellen afbreken zodat DNA vrijkomt
i. Bv. vriezen en ontdooien, mechanische en liquide homogenisatie, sonicatie en
buffer (zoals enzymes die RNA of eiwitten afbreken)
c. Isoleren
i. Bv. organische solventen, geconcentreerd zout en kolomchromatografie (DNA
bindt selectief aan matrix→ elutie= zet DNA vrij)
d. Oplossen in bepaalde vloeistof daarbij concentreren
2. Kwantificeren→ weten hoeveel DNA je hebt
a. Spectrofotometrie→ absorptie van licht door DNA oplossing
b. Spectrofluorimetrie→ fluorescentie vrijgezet na binden van moleculen aan DNA
c. Elektroforese→ scheiding van DNA op basis van grootte→ DNA van neg. naar pos.
pool→ kortere DNA fragmenten migreren sneller→ visualiseren via fluorescentie
3. Concentreren
a. Alcoholprecipitatie→ concentreren en opzuiveren
b. Concentrators→ centrifuge
c. Speedvac→ verdamping
4. Amplificeren
a. PCR
i. Denaturatie=de twee strengen van DNA losmaken van elkaar/DNA openen
ii. Annealing/hybridisatie=primer binden aan DNA
iii. Extensie/elongatie
iv. New template DNA→ start cyclus over
DNA karakteriseren (Methoden 3!):
5. Sequencing= volgorde DNA aflezen
a. 1ste generation= 1 sequentie per keer met amplificatie
i. Sanger→ gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt door cloneren of
PCR→ Door ddNTP’s vele fragmenten met verschillende lengtes→ Analyse
via elektroforese→ fluorescente label op ddNTP’s dus weten waarop een
fragment eindigt→ Visualisatie in elektroferogram→ kwaliteitscontrole met
Phred score
1. Voordeel: mutatie detectie
2. Nadeel: moeite met herhalingen→ lezen langs twee kanten
3. Toepassing: Human Genome Project
b. 2nd generation= meerdere korte sequenties tegelijk met amplificatie
i. 4 stappen:
1. Aanmaak DNA library= verzameling van templates die je wilt gaan
sequencen
a. Input DNA kwaliteitscontrole
b. Random fragmentatie
c. End repair
, i. Blunt ends maken=beide strands gelijke afmeting
ii. 5’ uiteinde fosforyleren om adaptor te ligeren
iii. Eventueel 3’ taq-polymerase= A aan uiteinde hangen
zodat adaptor makkelijker ligeert
d. Adapters aanhechten
e. Alternatief: Tagmentatie= fragmentatie en adapters
aanhechten in één keer
f. Size selection→ agarose gel-elektroforese of magnetische
beads
g. Kwaliteitscontrole→ capillaire elektroferose
2. Klonale in vitro amplificatie
a. Emulsie PCR→ 1 bead in 1 druppel water gescheiden door
olie→ on bead PCR
b. Solid-phase bridge amplification→ DNA bindt random aan
een primer op het plaatje→ buigt tot het de complementaire
primer tegenkomt→ start polymerase
c. Solid phase template walking ‘wildfire’→ Oppervlak met
oligo’s complementair aan adaptoren→ Fragmenten laten
binden→Partiële denaturatie waardoor vrije uiteinden
‘wandelen’ lokaal amplificatie
d. Rolling circle amplification→ DNA fragment en adaptoren in
cirkel→ amplificatie en hybridiseren op plaatje
3. Sequencing
a. Sequencing-by-synthesis met reversible chain-terminators→
Ingebouwd van 1 terminal nucleotide (ddNTP)→gelabeled
met fluophore→ lees kleur→ kan beide afgooien→
opnieuw→ leest één base af
b. Sequencing-by-synthesis met een single nucleotide=
pyrosequencing→ Voeg één nucleotide toe→ kan twee
dingen meten (pyrofosfaat&proton)→pyrofosfaat komt vrij
en door omzetting van ATP→ activeert luciferase→
lichtflits→ vier nucleotide apart inbrengen
c. Ion-semiconductor sequencing→ Nucleotide wordt
toegevoegd→ proton komt vrij H+→ lading meten door
stroom meten→ stroomverandering→ aparte nucleotiden
d. Sequencing by ligation→ Ligase ipv polymerase→
Template+gebonden primer→ mengsel van oligonucleotiden
met elke een kleur → bepaald oligonucleotiden bindt op basis
van complementariteit→ Weet de eerste twee basen→ knipt
fluorescente groep +laatste 3 basen→ opnieuw
i. Voordeel: hoge accuraatheid→ geen last van
homopolymeren
ii. Nadeel: korte sequenties
4. Data analyse
ii. Platforms
1. 454/ Roche Genome Sequencer FLX (historisch)
a. Gebaseerd op: emulsion-based cloning en PCR en
pyrophosphate based sequencing
b. Voordeel: lange sequenties
c. Nadeel: fouten bij homopolymeren en indels en kostprijs te
hoog tov competitie
, d. Data analyse: flowgram→ aantal fotonen per flow tellen, in
elke flow wordt maar één dNTP aangeleverd, aantal
herhalingen van die base bepaald op basis van
drempelwaarden
e. Toepassing: genoom sequentie
2. ABI-SOLID platform (historisch)
a. Gebaseerd op: emulsie PCR en sequencing by hybridization
and ligation
b. Voordeel: hoge accuraatheid→ geen problemen met
homopolymeren→ handig naar kijken mutaties
c. Nadeel: korte sequenties→ moeilijk de novo seq. en traag,
3. Illumina
a. Gebaseerd op: bridge amplification en fluorescent reversible
chain termination sequencing
b. Voordeel: lage kostprijs, hoge throughput en accuraatheid→
weinig problemen met homopolymeren
c. Nadeel: korte sequenties
d. Toepassing:
i. Verspreiding van mensen/evolueert vanuit origine
ii. Mutaties oncologie
iii. Genoom van mammoet seq.
iv. Covid seq.
v. Gepersonaliseerde geneeskunde
vi. WES, WGS, targeted sequencing
4. Ion torrent
a. Gebaseerd op: emulsie PCR en ion semiconductor sequencing
b. Voordeel:
i. Snel
ii. Geen gemodificeerde nucleotiden
iii. Real time aflezing
iv. Geen enzymatische tussenstappen
v. Lage kostprijs per reactie en toestel
vi. Flexibel
vii. Vele toepassingen: amplicons, viraal DNA…
c. Nadeel:
i. Fouten bij homopolymeers
ii. Relatief korte sequenties
iii. Beperkte capaciteit (per run)
iii. Voordeel 2nd gen. seq.→ snelle en goedkope manier individuele genomen
seq. en weinig DNA template nodig
iv. Nadeel→ korte sequenties en soms lage accuraatheid
c. 3rd generation=1 DNA molecuul sequencen ZONDER amplificatie
i. Platforms
1. Single Molecule Real Time (SMRT) platform (PacBio)
a. Kleine putjes→ per putje één polymerase→ kan DNA streng
vastpakken met een primer en dan synthese→ Wanneer een
nucleotide wordt ingebouwd, wordt pyrofosfaat samen met de
fluorescente groep vrijgezet→ licht gemeten dicht bij de
onderkant van de put
, b. Accuraatheid verhoogd door hairpin→ Uiteinde hairpin vast
ligeren→ circulair gesequenced→ blijven sequencen
(meerder keren dezelfde fragment)
c. Voordeel:
i. Lange sequenties
ii. Geen amplificatie
iii. Hoge accuraatheid
iv. Lage cost per read
d. Toepassing: familiale vorm van epilepsie
2. Nanopore sequencing
a. Membraan waar heel klein poriën in zitten→ met motor eiwit
enkelstreng DNA door de porien duwen→ omdat er normaal
ionen doorheen gaan, verstopt de nucleotide de weg→ dit laat
de stroom dalen→ elke nucleotide verschillende stroom
b. Leaderhairpin zodat beide strengen kunnen worden
gesequenced→ hogere accuraatheid
c. Voordeel: lange sequenties
d. Nadeel: makkelijk fouten door kleine verschillen in stroom→
oplossing: Stratos Genomics (Roche) → elke nucleotide in
orginele template wordt geëxpandeerd (X-NTP’s)→ verschil
stroom groter
e. Toepassing: seq. covid, vele genomen seq. voor bijv.
kankergenomics, complexere stukjes van human genome seq.
voor Whole Genome Project
ii. Voordeel 3rd gen. seq.→ lange sequenties en geen amplificatie (→ geeft bias
want sommige stukken makkelijker geamplificeerd)
iii. Nadeel→ single pass aflezen van molecule heeft hoge error rate
d. Epigenetica sequentiebepaling
i. Epigenetica= modificaties aan basen die de genexpressie regelen→ nieuwe
uitdaging
ii. Belangrijkste chemische modificatie in mens DNA methylatie
5methylcytosine (5mC) in CpG
iii. Methodes:
1. Bisulfiet-conversie= gouden standaard
a. Bisulfiet converteert niet-gemethyleerde C naar U (in PCR→
T), gemethyleerde C blijft behouden
b. Resolutie is single base en kan >28miljoen CpGs meten
c. Voordeel: kan elke CpG afzonderlijk bepalen en leent zich tot
next-gen. seq.
d. Nadeel:
i. Hogere kosten
ii. Hogere DNA input
iii. DNA gedegradeerd
iv. Sterke chemische reactie kan DNA beschadigen
2. Restrictie enzyme
a. Methylatie-gevoelige restrictie enzymes klieven de restrictie-
site
b. Resolutie is single base en kan ongv. 2miljoen CpGs meten
c. Voordeel: hoge sensitiviteit en lagere kosten
d. Nadeel: beperkt to regio’s met restrictie-site
