Samenvatting MBT
Isolatie DNA en RNA
Als je DNA/RNA wilt isoleren, moet je altijd schoon werken DNAse en RNAse vrij. Ook werk je
altijd op ijs.
DNA -isolatie voor sequencing, RNA-isolatie voor genexpressie en eiwitisolatie voor functie/plek
eiwit.
Homogenisatie: cellen los van elkaar maken.
Lyse: het kapot maken van cellen.
Stap 1: Het kapot maken van het biologische materiaal
- Sonificatie (niet vaak gebruikt)
- Osmotisch zoutconcentratie verhogen/verlagen
- Enzymatisch lysozym of proteinase K
- Door in te vriezen en vervolgens te ontdooien ijskristallen beschadigen het celmembraan
PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) wordt gebruikt om vooraf de cellen te wassen. Hierbij
verdwijnen mediumcomponenten en mogelijk DNAse, RNAse en proteases.
Stap 2: Het toevoegen van een zoutoplossing voor verdere scheiding
Stap 3: Het toevoegen van een detergentia (Triton X-100 of SDS)
- Membranen lossen op in de cel hierdoor gaten in de membranen
- Eiwitten ontvouwen
- Watermantel wordt verdreven
Stap 4: Binden aan silicagel
Door de aanwezigheid van een chaotroop kan DNA/RNA binden aan de silicagel. Als dit vervolgens bij
de elutie wordt gewassen met water/TE buffer, verdwijnt de chaotroop en laten de DNA/RNA
moleculen los van de silicagel. Er moet alcohol in de oplossing aanwezig zijn, hierdoor slaat een deel
neer en bindt DNA/RNA beter. Bij isolatie van DNA wordt er RNAse toegevoegd en bij isolatie van
RNA wordt er DNAse toegevoegd.
DNAse onschadelijk maken:
- Temperatuur verlagen, zo wordt de werking verminderd.
- EDTA of EGTA toevoegen, deze vangen Magnesium en Calcium ionen (cofactoren van DNAse)
weg. EGTA is selectiever voor Calcium ionen
- DNAse wordt gedenatureerd door middel van autoclavering (pipetpuntjes, glaswerk etc.)
RNAse onschadelijk maken:
Geen cofactor nodig en na autoclavering kunnen ze weer in de originele vorm terug vouwen.
RNAse vernietigd in kleine hoeveelheid al snel RNA. Als bescherming tegen infecties door virussen
met een RNA-genoom scheidt het lichaam grote hoeveelheden RNAse uit. RNA moet altijd in de
vriezer bewaard worden.
- Tijd laten staan in DEPC, dit inactiveert enzymen door het te modificeren. De oplossing kan
DEPC vrij worden gemaakt door autoclavering.
, Eiwitten kunnen worden afgebroken door proteases. De groep met Zink als cofactor kan worden
geremd met protease-inhibitors.
PCR
De reden om een PCR uit te voeren kan zijn: klonering (hele gen amplificeren), detectie (deel van gen
amplificeren).
Termen DNA replicatie (in de cel):
Origin of replication: het startpunt van de DNA replicatie
Topoisomerase: ontvouwt de DNA-strengen
Helicase: opent het DNA bij de replicatievork
Single-strand binding proteins: zorgt dat de open DNA keten niet opnieuw een dubbele helix kan
vormen.
Primase: synthetiseert RNA primers complementair aan de DNA streng
DNA-polymerase: synthetiseert DNA van 5’ naar 3’ leest af van 3’ naar 5’.
Door een ander soort DNA-polymerase worden de RNA primers vervangen door DNA
DNA ligase: ligeert de DNA-fragmenten
Stappen PCR:
Denaturatie: waterstofbruggen worden verbroken, hierdoor wordt DNA enkelstrengs.
Annaeling: DNA-primers kunnen aan de complementaire sequentie in de strengen hechten.
Extensie: losse nucleotiden worden door Taq-DNA-polymerase aan de DNA strengen toegevoegd,
zodat DNA weer dubbelstrengs wordt.
Temperatuur en duur fases:
Benodigdheden voor PCR:
DNA monster, primers, nucleotiden (dNTP’s), Taq-polymerase, buffer mix en PCR epje.
Het epje is dunwandig, zodat de temperaturen in het epje snel kunnen veranderen.
In de buffer zit vaak Magnesium, dit is een cofactor voor DNA-polymerase, het stabiliseert ook de
DNA-helixen. Hiervan moet niet teveel toegevoegd worden, anders worden er verkeerde nucleotiden
ingebouwd door de stabiliteit. De buffer bevat ook KCl (optimale binding primers) en Tris (optimale
pH voor enzym).
Isolatie DNA en RNA
Als je DNA/RNA wilt isoleren, moet je altijd schoon werken DNAse en RNAse vrij. Ook werk je
altijd op ijs.
DNA -isolatie voor sequencing, RNA-isolatie voor genexpressie en eiwitisolatie voor functie/plek
eiwit.
Homogenisatie: cellen los van elkaar maken.
Lyse: het kapot maken van cellen.
Stap 1: Het kapot maken van het biologische materiaal
- Sonificatie (niet vaak gebruikt)
- Osmotisch zoutconcentratie verhogen/verlagen
- Enzymatisch lysozym of proteinase K
- Door in te vriezen en vervolgens te ontdooien ijskristallen beschadigen het celmembraan
PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) wordt gebruikt om vooraf de cellen te wassen. Hierbij
verdwijnen mediumcomponenten en mogelijk DNAse, RNAse en proteases.
Stap 2: Het toevoegen van een zoutoplossing voor verdere scheiding
Stap 3: Het toevoegen van een detergentia (Triton X-100 of SDS)
- Membranen lossen op in de cel hierdoor gaten in de membranen
- Eiwitten ontvouwen
- Watermantel wordt verdreven
Stap 4: Binden aan silicagel
Door de aanwezigheid van een chaotroop kan DNA/RNA binden aan de silicagel. Als dit vervolgens bij
de elutie wordt gewassen met water/TE buffer, verdwijnt de chaotroop en laten de DNA/RNA
moleculen los van de silicagel. Er moet alcohol in de oplossing aanwezig zijn, hierdoor slaat een deel
neer en bindt DNA/RNA beter. Bij isolatie van DNA wordt er RNAse toegevoegd en bij isolatie van
RNA wordt er DNAse toegevoegd.
DNAse onschadelijk maken:
- Temperatuur verlagen, zo wordt de werking verminderd.
- EDTA of EGTA toevoegen, deze vangen Magnesium en Calcium ionen (cofactoren van DNAse)
weg. EGTA is selectiever voor Calcium ionen
- DNAse wordt gedenatureerd door middel van autoclavering (pipetpuntjes, glaswerk etc.)
RNAse onschadelijk maken:
Geen cofactor nodig en na autoclavering kunnen ze weer in de originele vorm terug vouwen.
RNAse vernietigd in kleine hoeveelheid al snel RNA. Als bescherming tegen infecties door virussen
met een RNA-genoom scheidt het lichaam grote hoeveelheden RNAse uit. RNA moet altijd in de
vriezer bewaard worden.
- Tijd laten staan in DEPC, dit inactiveert enzymen door het te modificeren. De oplossing kan
DEPC vrij worden gemaakt door autoclavering.
, Eiwitten kunnen worden afgebroken door proteases. De groep met Zink als cofactor kan worden
geremd met protease-inhibitors.
PCR
De reden om een PCR uit te voeren kan zijn: klonering (hele gen amplificeren), detectie (deel van gen
amplificeren).
Termen DNA replicatie (in de cel):
Origin of replication: het startpunt van de DNA replicatie
Topoisomerase: ontvouwt de DNA-strengen
Helicase: opent het DNA bij de replicatievork
Single-strand binding proteins: zorgt dat de open DNA keten niet opnieuw een dubbele helix kan
vormen.
Primase: synthetiseert RNA primers complementair aan de DNA streng
DNA-polymerase: synthetiseert DNA van 5’ naar 3’ leest af van 3’ naar 5’.
Door een ander soort DNA-polymerase worden de RNA primers vervangen door DNA
DNA ligase: ligeert de DNA-fragmenten
Stappen PCR:
Denaturatie: waterstofbruggen worden verbroken, hierdoor wordt DNA enkelstrengs.
Annaeling: DNA-primers kunnen aan de complementaire sequentie in de strengen hechten.
Extensie: losse nucleotiden worden door Taq-DNA-polymerase aan de DNA strengen toegevoegd,
zodat DNA weer dubbelstrengs wordt.
Temperatuur en duur fases:
Benodigdheden voor PCR:
DNA monster, primers, nucleotiden (dNTP’s), Taq-polymerase, buffer mix en PCR epje.
Het epje is dunwandig, zodat de temperaturen in het epje snel kunnen veranderen.
In de buffer zit vaak Magnesium, dit is een cofactor voor DNA-polymerase, het stabiliseert ook de
DNA-helixen. Hiervan moet niet teveel toegevoegd worden, anders worden er verkeerde nucleotiden
ingebouwd door de stabiliteit. De buffer bevat ook KCl (optimale binding primers) en Tris (optimale
pH voor enzym).
