H1: DNA-KLONERING
1. DNA-klonering
Wat? • Doel = maken van vele identieke kopijen van een stuk
DNA (bv. een gen)
• Werking
1) gen van interesse (GOI) wordt in een circulair
plasmide gebracht => vorming recombinant DNA
2) bacteriële transformatie en selectie
3) bacteriën zullen het plasmide vermenigvuldigen
4) plasmide DNA kan gezuiverd worden en gebruikt
worden om organismen te modificeren, het
gekloneerde GOI te bestuderen of eiwit te
produceren
Hoe? = 2 manieren
1. Knippen en plakken van DNA
- RE = zullen zowel het GOI als de vector digesteren/knippen => ontstaan sticky/blunt ends
- DNA-ligase = ligeert het GOI in de vector
2. Polymerase chain reaction = PCR
- je gaat een specifiek DNA-fragment amplificeren
- fragment voorzien van elementen (vb. herkenningsplaatsen voor RE) die specifieke insertie in
een plasmide toelaten
2. PCR
Doel = aanmaken van een groot aantal
b kopijen van een specifiek stuk DNA
Wat? = Polymerase Chain Reactionv
• Polymerase = DNA afhankelijk h DNA-polymerase
- uitzondering = 1e stap RT-PCR = reverse transcriptase PCR die mRNA omzet tot cDNA (afkomstig
van retrovirussen)
→ cDNA = heeft geen intronen en bacteriën doen niet aan splicing, dus cDNA is goed voor
klonering van eukaryote genen in bacteriën
- thermostabiel polymerase
- met of zonder proof-reading activiteit = 3’ -> 5’ exonuclease activiteit
- heeft nood aan een vrije 3’OH groep voor binding met de primer
• Chain reaction
= kettingreactie die zorgt voor een exponentiële DNA-amplificatie
Werking
Componenten Mastermix
• DNA afhankelijk DNA-polymerase (‘proof-reading’ of niet)
• dNTP mix = bouwstenen van het gesynthetiseerde DNA (deoxynucleotiden)
, • Juiste buffer => pH, zoutconcentratie voor het enzym
• BSA als stabiliserend eiwit = als we BSA in overmaat gaan toevoegen zal het aan de wand van de
tube plakken i.p.v. het RE. Hierdoor vermijden we dat het RE aan de
tube plakt en een eventuele conformatieverandering ondergaat
• Mg2+ ionen als cofactor voor polymerase en stabilisatie primer-template complex => conc. kan
geoptimaliseerd worden 1-4 mM Mg2+
Template DNA (of RNA)
= het DNA dat het amplicon bevat dat we willen amplificeren
→ teveel template DNA kan reactie inhiberen
→ DNA bindt Mg2+ ionen ter stabilisatie van zijn structuur waardoor Mg2+ ionen niet meer beschikbaar
zijn als cofactor voor het polymerase
→ grotere kans op aspecifieke binden van primers en template
Primers
→ zorgen voor de specificiteit van de reactie
→ Synthetische aanmaa
→ kunnen artificiële nucleotidesequentie toevoegen
=> het ontwerp is belangrijk voor een goede primer
Toepassingen • Analytisch = is er een bepaald soort DNA aanwezig in een mengsel?
- Polymerase proof reading is dikwijls onbelangrijk (Taq polymerase)
- Primer bepaalt de specificiteit
→ juiste ampliconlengte (kolonie-PCR, forensisch onderzoek, genotypering)
→ kwantificatie (QPCR)
- Agarose gelelektroforese
→ scheiding volgens grootte
→ visualisatie (ethiumbromide, SYBR Safe, Gelred, Gelgreen)
• Preparatief
- Polymerase proof reading activiteit is belangrijk (Vent of Pfu polymerase)
→ vermijden van mutaties
→ belangrijk voor DNA-klonering
Primerontwerp
Algemeen • Wat is een goede primer?
- lengte = 15 – 30 nucleotiden lang
→ ontzout na synthese
→ indien lange primers (> 40 nt): bestel extra gezuiverde primers (eg. HPLC of PAGE
gezuiverd)
- Smelttemperatuur tussen 55-70°C
→ vuistregel Tm= 2*(A+T)+4*(G+C)
→ verschil in smeltemp. tussen beide primers < 5°C
→ annealingstemperatuur voor Taq-polymerase: Ta = Tm-5°C
- moet specifiek zijn
→ binding oiv basecomplementariteit
→ minimale homologie met andere dan de doelwitsequentie (van het input DNA)
- GC-gehalte tussen 40 en 60% en homogeen verdeeld
- GC-clamp = G of C op 3’ uiteinde
→ niet meer dan 3 opeenvolgende aan 3’ eind > anders teveel kans op aspecificieke
priming
- Geen secundaire structuren
→ geen zelfcomplementariteit (hairpin)
→ geen primer dimeren (hetero-, homo-)
→ vooral belangrijk dat geen secundaire structuur met 3’ einde, want:
1) het 3’ uiteinde moet vrij zijn voor basenparing met het doelwit
2) bij een secundaire structuur met het 3’ inzittend einde is er een problematische
verlenging van de primer mogelijk (5’ eidne als template) en is de primer
verloren voor specifieke amplificatie
➔ polymerase kan niet polymeriseren startende van 5’ fosfaatgroep
,Algemeen: 1. Identificeer een geschikte (plasmide-) vector afhankelijk van de finale toepassing
klonering- - voorbeelden
primers → vector voor subklonering van DNA-fragmenten =
pUC, pENTR
→ eiwitexpressie: bacterieel (pET), gist (pPICZalpha),
insect (pFastBac), zoogdiercellen (pcDNA)
→ geschikte eiwitfusies (vb. Eiwit-tags)
→ rapporteer constructen (promotor + rapporteergen)
2. Identificeer de nucleotiden- / aminozuursequentie die je
wil kloneren
- via databanken (vb. NCBI)
- eventuele codon-optimalisatie, aangezien elk organisme een specifiek codongebruik heeft
- collecteer het template DNA
→ als dit mRNA is, kan dit worden omgezet tot cDNA met RT-PCR met reverse transriptase
→ bestellen van template DNA
3. Identificeer een geschikte kloneringsstrategie
- Restrictie – ligatie klonering (knippen en plakken)
- ‘Golden gate cloning’ (speciale vorm van knippen en plakken)
- ‘Sequence and ligation independent cloning (SLIC)’
- ‘Gibson assembly’
- ‘GeneArt® Seamless cloning’ and ‘In-Fusion® cloning’
- ‘GatewayTM cloning’
4. Ontwerp geschikte kloneringsprimers op basis van de in 1, 2 en 3 geïdentificeerde kenmerken
- Hou zoveel mogelijk rekening met de eigenschappen van een goede primer (zie eerder)
- Het codongebruik / leesraam wordt vastgelegd door het startcodon!!!
PCR-klonering Primers worden synthetisch gemaakt:
- Naast het complementair primerdeel kunnen extra nucleotiden worden toegevoegd
bvb. een restrictiesite:
= via PCR kan zo elke sequentie geflankeerd worden door restrictiesites, men kan
deze zo kiezen dat ze compatibel zijn met restrictiesites in het doelwitplasmide
- Directionele klonering
= gebruik 2 verschillende restrictie-enzymen R1 en R2 waarbij de gegenereerde
uiteinden door R1 niet compatibel zijn met R2, dus het fragment kan er maar op een
manier (richting) in het plasmide geligeerd worden
Keuze van restrictie-enzymen
- klassieke restrictie en ligatie klonering = RE mag niet knippen in het insert
=> analyseren: eg. Addgene sequence analyzer, NEB cutter V2,0,…
- Herkenningssequentie = aanwezig op de gewenste plaats (eg. MCS) in het doelwitplasmide (nergens
anders in vector)
, => bepalen a.d.h.v. informatie / plasmidemap van de gebruikte vector
- Bij voorkeur goede werking van beide enzymen in dezelfde buffer (NEBcloner, promega restriction
enzyme tool,…)
→ opgelet = mogelijke ‘star’ activiteit (knippen van gelijkaardige maar niet identieke sequenties als RE-
site, dit gebeurt onder niet ideale reactiecondities) !!!
- methylatie-gevoeligheid van RE
= RE zullen ook een mthylase-activiteit hebben zodat de RE niet inwerken op het eigen DNA
→ meeste E. coli labostammen hebben 3 methylasen: Dam, Dcm en EcoKI (er zijn ook Dam-, Dcm-
stammen)
Voorbeelden van restrictie klonering en methylatie
Restrictie- Een basis koneringsprimer bevat 2 functionele elementen:
ligatie 1. Hybridisatie sequentie = is een sequentie complementair aan het template DNA
klonering = dit deel bepaalt de annealing temperatuur in de eerste cycli van de PCR
2. Sequentie met elementen voor klonering
- restrictiesite = klassieke restrictie-ligatieklonering met PCR template
→ met voorafgaande nucelotiden = knippen dicht tegen het einde v/e DNA fragment
- homologe sequentie met de doelwitvector (SLIC, Gibson, GeneArt seamless, In-Fusion)
3. Optioneel kan een korte fusie (Tag) in de primer gecodeerd worden
Voorbeeld
We wensen het inflammatoir humaan cytokine TNFα recombinant aan te maken in E. coli. Na expressie
wensen we het eiwit te zuiveren aan de hand van nikkel-affiniteitszuivering.
- We kiezen een induceerbare bacteriële expressievector
- Een His-tag fusie is nodig voor de nikkel-affiniteitszuivering
= voorzien in primer of keuze van een vector die de His-tag reeds bevat (Vb. pET28a)
Er wordt gebruik gemaakt van de induceerbare bacteriële expressievector: pET28a
= bevat reeds een His-tag
- Stel = We hebben reeds een template DNA met geoptimaliseerd codongebruik voor E. coli en
wensen dit over te kloneren naar de pET28a vector.
→ We wensen de His-tag na de zuivering verwijderen dmv thrombine protease.
→ N-Terminale His-tag uit de vector te gebruiken waarna reeds een thrombine protease
site is voorzien.
1. DNA-klonering
Wat? • Doel = maken van vele identieke kopijen van een stuk
DNA (bv. een gen)
• Werking
1) gen van interesse (GOI) wordt in een circulair
plasmide gebracht => vorming recombinant DNA
2) bacteriële transformatie en selectie
3) bacteriën zullen het plasmide vermenigvuldigen
4) plasmide DNA kan gezuiverd worden en gebruikt
worden om organismen te modificeren, het
gekloneerde GOI te bestuderen of eiwit te
produceren
Hoe? = 2 manieren
1. Knippen en plakken van DNA
- RE = zullen zowel het GOI als de vector digesteren/knippen => ontstaan sticky/blunt ends
- DNA-ligase = ligeert het GOI in de vector
2. Polymerase chain reaction = PCR
- je gaat een specifiek DNA-fragment amplificeren
- fragment voorzien van elementen (vb. herkenningsplaatsen voor RE) die specifieke insertie in
een plasmide toelaten
2. PCR
Doel = aanmaken van een groot aantal
b kopijen van een specifiek stuk DNA
Wat? = Polymerase Chain Reactionv
• Polymerase = DNA afhankelijk h DNA-polymerase
- uitzondering = 1e stap RT-PCR = reverse transcriptase PCR die mRNA omzet tot cDNA (afkomstig
van retrovirussen)
→ cDNA = heeft geen intronen en bacteriën doen niet aan splicing, dus cDNA is goed voor
klonering van eukaryote genen in bacteriën
- thermostabiel polymerase
- met of zonder proof-reading activiteit = 3’ -> 5’ exonuclease activiteit
- heeft nood aan een vrije 3’OH groep voor binding met de primer
• Chain reaction
= kettingreactie die zorgt voor een exponentiële DNA-amplificatie
Werking
Componenten Mastermix
• DNA afhankelijk DNA-polymerase (‘proof-reading’ of niet)
• dNTP mix = bouwstenen van het gesynthetiseerde DNA (deoxynucleotiden)
, • Juiste buffer => pH, zoutconcentratie voor het enzym
• BSA als stabiliserend eiwit = als we BSA in overmaat gaan toevoegen zal het aan de wand van de
tube plakken i.p.v. het RE. Hierdoor vermijden we dat het RE aan de
tube plakt en een eventuele conformatieverandering ondergaat
• Mg2+ ionen als cofactor voor polymerase en stabilisatie primer-template complex => conc. kan
geoptimaliseerd worden 1-4 mM Mg2+
Template DNA (of RNA)
= het DNA dat het amplicon bevat dat we willen amplificeren
→ teveel template DNA kan reactie inhiberen
→ DNA bindt Mg2+ ionen ter stabilisatie van zijn structuur waardoor Mg2+ ionen niet meer beschikbaar
zijn als cofactor voor het polymerase
→ grotere kans op aspecifieke binden van primers en template
Primers
→ zorgen voor de specificiteit van de reactie
→ Synthetische aanmaa
→ kunnen artificiële nucleotidesequentie toevoegen
=> het ontwerp is belangrijk voor een goede primer
Toepassingen • Analytisch = is er een bepaald soort DNA aanwezig in een mengsel?
- Polymerase proof reading is dikwijls onbelangrijk (Taq polymerase)
- Primer bepaalt de specificiteit
→ juiste ampliconlengte (kolonie-PCR, forensisch onderzoek, genotypering)
→ kwantificatie (QPCR)
- Agarose gelelektroforese
→ scheiding volgens grootte
→ visualisatie (ethiumbromide, SYBR Safe, Gelred, Gelgreen)
• Preparatief
- Polymerase proof reading activiteit is belangrijk (Vent of Pfu polymerase)
→ vermijden van mutaties
→ belangrijk voor DNA-klonering
Primerontwerp
Algemeen • Wat is een goede primer?
- lengte = 15 – 30 nucleotiden lang
→ ontzout na synthese
→ indien lange primers (> 40 nt): bestel extra gezuiverde primers (eg. HPLC of PAGE
gezuiverd)
- Smelttemperatuur tussen 55-70°C
→ vuistregel Tm= 2*(A+T)+4*(G+C)
→ verschil in smeltemp. tussen beide primers < 5°C
→ annealingstemperatuur voor Taq-polymerase: Ta = Tm-5°C
- moet specifiek zijn
→ binding oiv basecomplementariteit
→ minimale homologie met andere dan de doelwitsequentie (van het input DNA)
- GC-gehalte tussen 40 en 60% en homogeen verdeeld
- GC-clamp = G of C op 3’ uiteinde
→ niet meer dan 3 opeenvolgende aan 3’ eind > anders teveel kans op aspecificieke
priming
- Geen secundaire structuren
→ geen zelfcomplementariteit (hairpin)
→ geen primer dimeren (hetero-, homo-)
→ vooral belangrijk dat geen secundaire structuur met 3’ einde, want:
1) het 3’ uiteinde moet vrij zijn voor basenparing met het doelwit
2) bij een secundaire structuur met het 3’ inzittend einde is er een problematische
verlenging van de primer mogelijk (5’ eidne als template) en is de primer
verloren voor specifieke amplificatie
➔ polymerase kan niet polymeriseren startende van 5’ fosfaatgroep
,Algemeen: 1. Identificeer een geschikte (plasmide-) vector afhankelijk van de finale toepassing
klonering- - voorbeelden
primers → vector voor subklonering van DNA-fragmenten =
pUC, pENTR
→ eiwitexpressie: bacterieel (pET), gist (pPICZalpha),
insect (pFastBac), zoogdiercellen (pcDNA)
→ geschikte eiwitfusies (vb. Eiwit-tags)
→ rapporteer constructen (promotor + rapporteergen)
2. Identificeer de nucleotiden- / aminozuursequentie die je
wil kloneren
- via databanken (vb. NCBI)
- eventuele codon-optimalisatie, aangezien elk organisme een specifiek codongebruik heeft
- collecteer het template DNA
→ als dit mRNA is, kan dit worden omgezet tot cDNA met RT-PCR met reverse transriptase
→ bestellen van template DNA
3. Identificeer een geschikte kloneringsstrategie
- Restrictie – ligatie klonering (knippen en plakken)
- ‘Golden gate cloning’ (speciale vorm van knippen en plakken)
- ‘Sequence and ligation independent cloning (SLIC)’
- ‘Gibson assembly’
- ‘GeneArt® Seamless cloning’ and ‘In-Fusion® cloning’
- ‘GatewayTM cloning’
4. Ontwerp geschikte kloneringsprimers op basis van de in 1, 2 en 3 geïdentificeerde kenmerken
- Hou zoveel mogelijk rekening met de eigenschappen van een goede primer (zie eerder)
- Het codongebruik / leesraam wordt vastgelegd door het startcodon!!!
PCR-klonering Primers worden synthetisch gemaakt:
- Naast het complementair primerdeel kunnen extra nucleotiden worden toegevoegd
bvb. een restrictiesite:
= via PCR kan zo elke sequentie geflankeerd worden door restrictiesites, men kan
deze zo kiezen dat ze compatibel zijn met restrictiesites in het doelwitplasmide
- Directionele klonering
= gebruik 2 verschillende restrictie-enzymen R1 en R2 waarbij de gegenereerde
uiteinden door R1 niet compatibel zijn met R2, dus het fragment kan er maar op een
manier (richting) in het plasmide geligeerd worden
Keuze van restrictie-enzymen
- klassieke restrictie en ligatie klonering = RE mag niet knippen in het insert
=> analyseren: eg. Addgene sequence analyzer, NEB cutter V2,0,…
- Herkenningssequentie = aanwezig op de gewenste plaats (eg. MCS) in het doelwitplasmide (nergens
anders in vector)
, => bepalen a.d.h.v. informatie / plasmidemap van de gebruikte vector
- Bij voorkeur goede werking van beide enzymen in dezelfde buffer (NEBcloner, promega restriction
enzyme tool,…)
→ opgelet = mogelijke ‘star’ activiteit (knippen van gelijkaardige maar niet identieke sequenties als RE-
site, dit gebeurt onder niet ideale reactiecondities) !!!
- methylatie-gevoeligheid van RE
= RE zullen ook een mthylase-activiteit hebben zodat de RE niet inwerken op het eigen DNA
→ meeste E. coli labostammen hebben 3 methylasen: Dam, Dcm en EcoKI (er zijn ook Dam-, Dcm-
stammen)
Voorbeelden van restrictie klonering en methylatie
Restrictie- Een basis koneringsprimer bevat 2 functionele elementen:
ligatie 1. Hybridisatie sequentie = is een sequentie complementair aan het template DNA
klonering = dit deel bepaalt de annealing temperatuur in de eerste cycli van de PCR
2. Sequentie met elementen voor klonering
- restrictiesite = klassieke restrictie-ligatieklonering met PCR template
→ met voorafgaande nucelotiden = knippen dicht tegen het einde v/e DNA fragment
- homologe sequentie met de doelwitvector (SLIC, Gibson, GeneArt seamless, In-Fusion)
3. Optioneel kan een korte fusie (Tag) in de primer gecodeerd worden
Voorbeeld
We wensen het inflammatoir humaan cytokine TNFα recombinant aan te maken in E. coli. Na expressie
wensen we het eiwit te zuiveren aan de hand van nikkel-affiniteitszuivering.
- We kiezen een induceerbare bacteriële expressievector
- Een His-tag fusie is nodig voor de nikkel-affiniteitszuivering
= voorzien in primer of keuze van een vector die de His-tag reeds bevat (Vb. pET28a)
Er wordt gebruik gemaakt van de induceerbare bacteriële expressievector: pET28a
= bevat reeds een His-tag
- Stel = We hebben reeds een template DNA met geoptimaliseerd codongebruik voor E. coli en
wensen dit over te kloneren naar de pET28a vector.
→ We wensen de His-tag na de zuivering verwijderen dmv thrombine protease.
→ N-Terminale His-tag uit de vector te gebruiken waarna reeds een thrombine protease
site is voorzien.
