PLANTBIOTECHNOLOGY
PLANT TRANSFORMATION: The Agrobacterium/plant cell interaction
THE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
❖ Plant pathogeen: induceert tumoren op 60% van dicotyle angiospermen en gymnospermen
“crown-gall” disease
o Crown = regio in plant waar stam en wortels connecteren
(net boven grond)
o Niet altijd op crown: op stam, wortels tegen bodemopp. …
Tumefaciens = “tumor-inducerend”
Tumor = plantencellen die ongecontroleerd delen
o Incubeerbaar op medium zonder fytohormonen (externe
stimuli) en zonder de bacterie, met water en suiker
(maltose)
Nutriënten van plant verkrijgen
Aangetrokken door gewonde planten
Transfereert genen van bacteriecel naar plantencellen
Economisch van belang: zieke wijnranken en fruitbomen
❖ Gram-negatieve bodembacterie
❖ Rhizobiaceae familie
Bacteriën induceren nodules op wortels Fabaceae → stikstoffixatie (N2 (atmosf.) → NH4+ (ammonium))
❖ Gebruikt als tool om transgene planten te maken (natural genetic engineering) → research + agricultuur
❖ Bv. het GUS-gene (reportergen, na promotorregio binnengebracht): visualisatie meristematische regio’s
Shoot meristeem, root meristeem, lateral roots… (foto)
❖ Bv. BT-gen → eiwitten geproduceerd door bacterie dat insecten doodt
Getransformeerde plant: insectresistent
❖ Heeft ons veel geleerd over hoe planten moleculair werken
Callus vs tumor
- Experiment: incubatie plantenblaadjes met water, suiker en 2 plantenhormonen → stimuleert de cellen om te
delen en een massa te vormen van niet-gedifferentieerde cellen = een callus
Auxin 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D)
Cytokinin zeatin
- Callus = gestimuleerd door externe stimuli, anders delen ze niet meer
- Tumor = niet gestimuleerd door externe stimuli
HISTORY OF AGROBACTERIUM
1907: Crown gallen zijn geïnduceerd door een bacterie
- Erwin Smith en C.O. townsend
- Micro-organismen geïsoleerd uit gal van een madeliefje → laten groeien op medium → andere planten
inoculeren → ook gallen
- Het bewijs dat ziekte door MO’s worden veroorzaakt
Armin C. Braun: gallen hebben de aanwezigheid van Agrobacterium niet nodig
- Doodde bacteriën in crown gall (T° verhogen / AB toevoegen) → cellen bleven delen
- Er is dus een permantente verandering gebeurd in plantencel → iets werd getransformeerd naar plant → TIP
THE “TUMOR INDUCING PRINCIPLE” (TIP)
❖ First clue: virulente vs avirulente Agro’s
Virulent: kunnen tumoren induceren → hebben groot plasmide
Avirulent: geen tumoren → geen plasmide
❖ Conjugatie experiment: avirulente stammen kregen plasmide via conjugatie van virulente → werden ook virulent
Dus plasmide = “Tumor inducing or Ti plasmide” (150 000 bp)
❖ Later: gevonden dat een deel van het Ti-plasmide door wordt gegeven aan de plantencel
T-DNA (Transferred DNA)
Interkingdom DNA transfer (pro → euk)
1
,GENES CARRIED BY THE T-DNA: PHYTOHORMONE BIOSYNTHESIS GENES
= enzymen die fytohormonen produceren → 3 fytohormoongenen op T-DNA:
❖ ipt (isopentenyl transferase): cytokinine biosynthese
stimuleert celdeling (cytokinesis)!
≠ cytokine!
❖ iaaM (Trp → indole acetamide) en iaaH: auxine biosynthese
- Bij de callus voegt men zelf fytohormonen toe. Hier: genen, oorpsr. uit bacterie, die zorgen dat plantencellen zelf
hormonen zullen maken
- Ongecontroleerde cytokinine en auxine overproductie → tumor
- Genen op bacterieel plasmide, maar onder controle van eukaryotic expression signals
Mogen niet actief zijn in bacterie, enkel in plant
3’ polyadenylatie signaal (zit niet in pro’s): poly-A-tail
Promotor
AUG startcodon (= typisch euk)
…
Biosynthese cytokinine
Ipt katalyseert de reactie →
produceert adenosine 5-fosfaat =
basis molecule voor cytokinine →
isopentalyl adenine
Hydroxylatie → zeatine
= meest voorkomende cytokinine
Beiden een plantenhormoon
Synthetische cytokinines
Meer gebruikt in labo: meer stabiel en
minder snelle degradatie
TDZ = molecule dat degradatie van
cytokinine blokkeert + controleert
hoeveelheid actieve cytokinine
aanwezig in de cel
2
,Biosynthese auxine
Trp → indole acetamine → indole
acetic acid = auxine = meest
belangrijke natuurlijk voorkomend
auxine in planten
IaaM en IaaH katalyseren reactie
Leidt ook tot celgroei/-deling
Synthetische en natuurlijke auxines
Indole butyric acid en chloroindole
acetic acid beiden natuurlijk in planten
Onderste rij: synthetisch
Napht. acid veel gebruikt
Experiment
Verschillende combinaties auxine (x-as) en cytokinine (y-as)
➔ Enkel cytokinine : induceert shoots
➔ Enkel auxine : induceert roots
➔ Midden : callus = ongedifferentieerd
GENES CARRIED BY THE T-DNA: OPINES
❖ Opines = geproduceerd door enzymen die ook vanuit het T-DNA komen:
octopine synthase (ocs): katalysatie arginine + pyruvaat tot octopine
nopaline synthase (nos)
lysopine synthase
etc…
❖ Het zijn suiker of aminozuur derivaten → geproduceerd in
de crown galls → komen vrij in omgeving = het voordeel
voor Agro: als koolstof of stikstof bron gebruikt
Plant wordt dus geforceerd deze moleculen aan te
maken
❖ Onder controle door eukaryotic expression signals
❖ Elke virulente Agro stam bevat één of meerdere opine
biosynthese genen op hun T-DNA
3
, GENETIC COLONIZATION
❖ Agro heeft zelf op het Ti-plasmide genen (buiten T-DNA) voor opine katabolisme → afbraak van opines
geproduceerd door plant
Prokaryote controle op genen / prokaryote kenmerken
Meeste andere bodembacteriën hebben dit niét
❖ Genetische kolonisatie: Agro modificeert de plant genetisch om de production factory te worden van opines die
worden gebruikt als C- en N-bron voor Agro
THE Ti-PLASMID
- 150 000 bp
- Meeste genen die nodig zijn voor plantceltransformatie liggen op
het Ti-plasmide, maar sommige liggen ook op het chromosoom
CHV = chromosomal virulence genes
- 3 belangrijke genetische elementen
T-DNA:
o Geflankeerd door 25 bp right/left borders (LB en RB)
▪ Imperfect: niet identiek aan elkaar
▪ 8 bp highly conserved
▪ Direct repeats: in dezelfde oriëntatie (bv. beiden naar
rechts)
o Kan verder opgesplitst worden in meerdere T-DNA’s, elk eigen LB en RB’s
De virulentie regio (vir) < vir operons → Vir proteïnen = regelen transport T-DNA copy naar plantcellen
Genen voor opine katabolisme
Ook : conjugative transfer genes → DNA overbrengen naar plant via conjugatie systeem
STAPPENPLAN
STAP 1: CHEMOTAXIS & ATTACHMENT
Agro is aangetrokken door gewonde plantcellen → hebben geen celwand meer
- Componenten plantcelwand: cellulose & lignine (= hoog gepolymeriseerde fenolische compounds)
- Wounded tissue: secretie van moleculen zoals suikers, AZ’s, fenolische compounds (van lignine) → °chemo-
taxis
- Eiwitten celwand Agro binden met eiwitten in plantencelmembraan (vitronectin-like proteins)
CHV’s coderen hiervoor → ChvA, ChvB…
4
PLANT TRANSFORMATION: The Agrobacterium/plant cell interaction
THE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
❖ Plant pathogeen: induceert tumoren op 60% van dicotyle angiospermen en gymnospermen
“crown-gall” disease
o Crown = regio in plant waar stam en wortels connecteren
(net boven grond)
o Niet altijd op crown: op stam, wortels tegen bodemopp. …
Tumefaciens = “tumor-inducerend”
Tumor = plantencellen die ongecontroleerd delen
o Incubeerbaar op medium zonder fytohormonen (externe
stimuli) en zonder de bacterie, met water en suiker
(maltose)
Nutriënten van plant verkrijgen
Aangetrokken door gewonde planten
Transfereert genen van bacteriecel naar plantencellen
Economisch van belang: zieke wijnranken en fruitbomen
❖ Gram-negatieve bodembacterie
❖ Rhizobiaceae familie
Bacteriën induceren nodules op wortels Fabaceae → stikstoffixatie (N2 (atmosf.) → NH4+ (ammonium))
❖ Gebruikt als tool om transgene planten te maken (natural genetic engineering) → research + agricultuur
❖ Bv. het GUS-gene (reportergen, na promotorregio binnengebracht): visualisatie meristematische regio’s
Shoot meristeem, root meristeem, lateral roots… (foto)
❖ Bv. BT-gen → eiwitten geproduceerd door bacterie dat insecten doodt
Getransformeerde plant: insectresistent
❖ Heeft ons veel geleerd over hoe planten moleculair werken
Callus vs tumor
- Experiment: incubatie plantenblaadjes met water, suiker en 2 plantenhormonen → stimuleert de cellen om te
delen en een massa te vormen van niet-gedifferentieerde cellen = een callus
Auxin 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D)
Cytokinin zeatin
- Callus = gestimuleerd door externe stimuli, anders delen ze niet meer
- Tumor = niet gestimuleerd door externe stimuli
HISTORY OF AGROBACTERIUM
1907: Crown gallen zijn geïnduceerd door een bacterie
- Erwin Smith en C.O. townsend
- Micro-organismen geïsoleerd uit gal van een madeliefje → laten groeien op medium → andere planten
inoculeren → ook gallen
- Het bewijs dat ziekte door MO’s worden veroorzaakt
Armin C. Braun: gallen hebben de aanwezigheid van Agrobacterium niet nodig
- Doodde bacteriën in crown gall (T° verhogen / AB toevoegen) → cellen bleven delen
- Er is dus een permantente verandering gebeurd in plantencel → iets werd getransformeerd naar plant → TIP
THE “TUMOR INDUCING PRINCIPLE” (TIP)
❖ First clue: virulente vs avirulente Agro’s
Virulent: kunnen tumoren induceren → hebben groot plasmide
Avirulent: geen tumoren → geen plasmide
❖ Conjugatie experiment: avirulente stammen kregen plasmide via conjugatie van virulente → werden ook virulent
Dus plasmide = “Tumor inducing or Ti plasmide” (150 000 bp)
❖ Later: gevonden dat een deel van het Ti-plasmide door wordt gegeven aan de plantencel
T-DNA (Transferred DNA)
Interkingdom DNA transfer (pro → euk)
1
,GENES CARRIED BY THE T-DNA: PHYTOHORMONE BIOSYNTHESIS GENES
= enzymen die fytohormonen produceren → 3 fytohormoongenen op T-DNA:
❖ ipt (isopentenyl transferase): cytokinine biosynthese
stimuleert celdeling (cytokinesis)!
≠ cytokine!
❖ iaaM (Trp → indole acetamide) en iaaH: auxine biosynthese
- Bij de callus voegt men zelf fytohormonen toe. Hier: genen, oorpsr. uit bacterie, die zorgen dat plantencellen zelf
hormonen zullen maken
- Ongecontroleerde cytokinine en auxine overproductie → tumor
- Genen op bacterieel plasmide, maar onder controle van eukaryotic expression signals
Mogen niet actief zijn in bacterie, enkel in plant
3’ polyadenylatie signaal (zit niet in pro’s): poly-A-tail
Promotor
AUG startcodon (= typisch euk)
…
Biosynthese cytokinine
Ipt katalyseert de reactie →
produceert adenosine 5-fosfaat =
basis molecule voor cytokinine →
isopentalyl adenine
Hydroxylatie → zeatine
= meest voorkomende cytokinine
Beiden een plantenhormoon
Synthetische cytokinines
Meer gebruikt in labo: meer stabiel en
minder snelle degradatie
TDZ = molecule dat degradatie van
cytokinine blokkeert + controleert
hoeveelheid actieve cytokinine
aanwezig in de cel
2
,Biosynthese auxine
Trp → indole acetamine → indole
acetic acid = auxine = meest
belangrijke natuurlijk voorkomend
auxine in planten
IaaM en IaaH katalyseren reactie
Leidt ook tot celgroei/-deling
Synthetische en natuurlijke auxines
Indole butyric acid en chloroindole
acetic acid beiden natuurlijk in planten
Onderste rij: synthetisch
Napht. acid veel gebruikt
Experiment
Verschillende combinaties auxine (x-as) en cytokinine (y-as)
➔ Enkel cytokinine : induceert shoots
➔ Enkel auxine : induceert roots
➔ Midden : callus = ongedifferentieerd
GENES CARRIED BY THE T-DNA: OPINES
❖ Opines = geproduceerd door enzymen die ook vanuit het T-DNA komen:
octopine synthase (ocs): katalysatie arginine + pyruvaat tot octopine
nopaline synthase (nos)
lysopine synthase
etc…
❖ Het zijn suiker of aminozuur derivaten → geproduceerd in
de crown galls → komen vrij in omgeving = het voordeel
voor Agro: als koolstof of stikstof bron gebruikt
Plant wordt dus geforceerd deze moleculen aan te
maken
❖ Onder controle door eukaryotic expression signals
❖ Elke virulente Agro stam bevat één of meerdere opine
biosynthese genen op hun T-DNA
3
, GENETIC COLONIZATION
❖ Agro heeft zelf op het Ti-plasmide genen (buiten T-DNA) voor opine katabolisme → afbraak van opines
geproduceerd door plant
Prokaryote controle op genen / prokaryote kenmerken
Meeste andere bodembacteriën hebben dit niét
❖ Genetische kolonisatie: Agro modificeert de plant genetisch om de production factory te worden van opines die
worden gebruikt als C- en N-bron voor Agro
THE Ti-PLASMID
- 150 000 bp
- Meeste genen die nodig zijn voor plantceltransformatie liggen op
het Ti-plasmide, maar sommige liggen ook op het chromosoom
CHV = chromosomal virulence genes
- 3 belangrijke genetische elementen
T-DNA:
o Geflankeerd door 25 bp right/left borders (LB en RB)
▪ Imperfect: niet identiek aan elkaar
▪ 8 bp highly conserved
▪ Direct repeats: in dezelfde oriëntatie (bv. beiden naar
rechts)
o Kan verder opgesplitst worden in meerdere T-DNA’s, elk eigen LB en RB’s
De virulentie regio (vir) < vir operons → Vir proteïnen = regelen transport T-DNA copy naar plantcellen
Genen voor opine katabolisme
Ook : conjugative transfer genes → DNA overbrengen naar plant via conjugatie systeem
STAPPENPLAN
STAP 1: CHEMOTAXIS & ATTACHMENT
Agro is aangetrokken door gewonde plantcellen → hebben geen celwand meer
- Componenten plantcelwand: cellulose & lignine (= hoog gepolymeriseerde fenolische compounds)
- Wounded tissue: secretie van moleculen zoals suikers, AZ’s, fenolische compounds (van lignine) → °chemo-
taxis
- Eiwitten celwand Agro binden met eiwitten in plantencelmembraan (vitronectin-like proteins)
CHV’s coderen hiervoor → ChvA, ChvB…
4
