Module II A, B, C

Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc


II. Methods and techniques in molecular biology
II.A. Genotyping of wild type and obese mice
II.A. Step 1: PCR
Datum: 13/03/23

Veiligheidsinformatie
Reagentia H-zinnen P-zinnen Belangrijkste E-classificatie Afvalcategorie
gevaren/voorzorgen
DreamTaq / / / / Biologisch
DNA afval
polymerase
(5 U µL-1)
DNA stalen / / / / Biologisch
afval


Alle andere reagentia die worden gebruikt in dit hoofdstuk zijn niet gevaarlijk of worden in dergelijk
lage concentraties of volumes gebruikt en worden als dusdanig niet als gevaarlijk beschouwd.
Wegens mogelijk contaminatie met DNA wordt al het afval tijdens dit practicum verzameld in het
biologisch afval.

Samenvatting: Er wordt altijd een labojas en veiligheidsbril gedragen in het laboratorium.



Procedure
Voor de procedure wordt verwezen naar de handleiding pagina 22 en 23. Ter verduidelijking: de
mastermix wordt gemaakt voor twee stalen dus we hebben driemaal de volumes uit de handleiding
nodig. Tijdens het uitvoeren worden wel alle producten zoveel mogelijk op het ijs gehouden.

Er werden ook short spins uitgevoerd om druppels te laten zakken in onze epjes.



Berekeningen en waarnemingen
In Tabel 1: Inhoud mastermix staan de hoeveelheden die samen de mastermix vormen.
Tabel 1: Inhoud mastermix

Reagens Hoeveelheid (µL)
Milli-Q water 38,25
10 x DreamTaq PCR-buffer 6
dNTP mix 6
OB-FW (primer) 1,5
OB-REV (primer) 1,5
DreamTaq DNA polymerase 0,75




1

,Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc
Taken en vragen
1. Discuss our choice of PCR primers (OB-FW and OB-REV). Did we follow the general guidelines?
Argument. Provide the output of the primer software!
In Tabel 1: Overzicht belangrijkste analytische resultaten primers worden alle belangrijke
gegevens van de primers weergegeven. Deze gegevens werden bekomen uit een paar
analytische resultaten, die terug te vinden zijn in Tabel 2: analytische resultaten primers. We
gaan nu de meest belangrijke eigenschappen, genoemd op pagina 20 en 21 in de handleiding,
nagaan. Het nucleotiden aantal van beide primers ligt tussen de 15 tot 30 nucleotiden. Beide
smelttemperaturen liggen boven de 58°C. Een te hoge smelttemperatuur zorgt voor een lager
aantal in PCR-producten. De GC-content ligt voor beide primers hoger dan 40%. Er kunnen bij
beiden primers secundaire structuren voorkomen, zoals self dimers, cross dimers en hairpins.
Bij OB-FW is ∆G positief en zullen er geen hairpins spontaan ontstaan. Bij OB-REV is de vorming
van hairpins echter wel spontaan wegens de positieve ∆G. Op dit vlak is OB-FW dus een betere
primer dan OB-REV. Beide primers kunnen self-dimers vormen. Deze reacties kennen allemaal
een negatieve ∆G. Het is echter pas een probleem wanneer deze ∆G’s van de vormingsreacties
kleiner zijn dan 10% van ∆Gmax . Voor OB-FW werd er één reactie gevonden met (∆G = -7,06
kcal / mol) > (10% ∆Gmax = -4,096 kcal / mol). Voor OB-REV zijn er twee reacties: [(∆G = -6,24
kcal / mol) en (∆G = -6,31 kcal / mol)] > (10% ∆Gmax = -3,917 kcal / mol). De reacties werden
voor de duidelijkheid aangeduid met een rode kader in Tabel 2: analytische resultaten primers.
Beide primers hebben dus een risico op het spontaan vormen van self-dimers.
Kortom kan de OB-FW primer werken, maar heeft een hoge Tm. Anderzijds is OB-REV minder
efficiënt door zijn mogelijkheid om ook hairpins te vormen. OB-REV zal minder snel gaan
binden aan de template streng. Beide primers hebben ze een hoog risico op het spontaan
vormen van self-dimers.
Tabel 2: Overzicht belangrijkste analytische resultaten primers

Kenmerken OB-FW OB-REV
Aantal nucleotiden 23 20
(Richtlijn: 15-30)
Tm (Richtlijn: 52-58°C) 68,9°C 73,5°C
GC-content (Richtlijn: > 40%) 43,4% 55%
Secundaire structuren Hairpins: Tm <17°C met Hairpins: 31°C <Tm <44°C
beperken ∆G>0 met ∆G<0
Cross homologie: vermijden Self-dimers: ∆G<0; ∆Gmax= - Self-dimers: ∆G<0; ∆Gmax = -
40,96 kcal/mol 39,17 kcal/mol>0


2

, Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc
Tabel 3: analytische resultaten primers

OB-FW OB-REV




Hairpins Hairpins




Self-dimers Self-dimers




3