Samenvatting bacteriologie en serologie DEEL 2

Medische virologie
Eigenschappen van virussen
1) Zéér klein (10 - 300 nm)
- pokkenvirus: 300 nm (grootste virus)
- Herpes virus: 100 nm
- picornavirus: 25 nm (kleinste virus)

2) obligaat intracellulair: obligaat intracellulair: beschikken wel
beschikken wel over een eigen nucleïnezuur, maar niet over een eigen eiwitsynthetiserend apparaat
(ribosomen)

3) genetisch materiaal bestaat uit genetisch materiaal bestaat uit 1 type nucleïnezuur nucleïnezuur: ofwel :
ofwel DNA, ofwel , ofwel RNA
Bouw van virussen
Zéér eenvoudige structuur
 nucleïnezuur omgeven door een nucleïnezuur omgeven door een
eiwitmantel (= eiwitmantel (= capside capside) opgebouwd uit
opgebouwd uit capsomeren
 soms ook soms ook envelop = lipoproteïnen (afkomstig van de
celmembraan, waarmee het virus wordt omhuld tijdens het verlaten van
de cel)
Virusclassificatie
Op basis van:
 Envelop: aan- of afwezigheid
 Capside:
o helicaal (= dakpansgewijs dakpansgewijs)
o icosahedraal (= zeer stabiele stabiele vorm)
o complex
 Genoom:
o DNA of RNA
o lineair of circulair
o 1 stuk of segmentair
Op basis van genoom
DNA-virussen virussen RNA-virussen virussen
1. PARVOVIRUSSEN 1. PICORNAVIRUSSEN
2. PAPOVAVIRUSSEN a. enterovirussen enterovirussen
3. ADENOVIRUSSEN b. rhinovirussen rhinovirussen
4. HERPESVIRUSSEN 2. REOVIRUSSEN
5. POKVIRUSSEN 3. ORTHOMYXOVIRUSSEN
4. PARAMYXOVIRUSSEN
5. TOGAVIRUSSEN
6. RHABDOVIRUSSEN
7. RETROVIRUSSEN
8. ARENAVIRUSSEN
9. CORONAVIRUSSEN

Virale replicatiecyclus
1) Aanhechting van het virus aan de celmembraan door binding aan cellulaire receptoren
2) Binnendringen binnendringen in de cel in de cel
a. Door versmelting met celmembraan van de cel (virussen met envelop)
b. Door vorming endosoom (naakte virussen)
c. Via specifieke receptoren (HIV-virus door binding op CCR5-receptoren)

, 3) Ontmanteling van het virusnucleïnezuur  virusnucleïnezuur ligt nu vrij in de cel
a. Capside wordt stukgemaakt door bv pH-verandering
4) Replicatie van virionen
a. synthese synthese van “vroege eiwitten”
b. replicatie van het nucleïnezuur (DNA/RNA)
c. synthese van “late eiwitten”
5) Assemblage van virionen  nucleïnezuur wordt omhuld met capside
6) Vrijkomen van virionen uit de cel
a. Ofwel door ‘budding’ en het virus zal omgeven worden door een envelop
b. Ofwel door cytolyse (bij naakte virussen)

Mogelijke aangrijpingspunten anti-virale middelen:
- aanhechting op de celmembraan en voorkomen van het binnendringen van het virus in de gastheercel
- replicatie van virale nucleïnezuren
- synthese van virale eiwitten
- assemblage van virionen
- vrijzetting van nieuwe virionen
laboratoriumdiagnostiek
1. rechtstreekse diagnose: aantonen van het virus zelf
- 1.1. Elektronenmicroscopie
< 200-300 nm: niet zichtbaar met lichtmicroscoop (soms wel insluitlichamen waar te nemen in de geïnfecteerde
cel = in de cel gelegen ophopingen van virussen)
belangrijk bij een eerste benadering: ontdekking van hepatitis virus , Ebola virus,…
VOORDELEN NADELEN
- Detecteert alle virussen (dus ook de - Hoge investeringskosten
niet kweekbare) - Lage gevoeligheid
- Lage werkingskosten - Ervaring vereist
- 1.2. Virusisolatie door kweek
virussen zijn obligaat intracellulair, d.w.z. dat levende cellen noodzakelijk zijn voor de vermenigvuldiging van
virussen
 proefdieren: coxsackievirussen in babymuizen
 bebroede kippeneieren (1930) voor influenzavirus
 celkweken (= cellijnen, weefselculturen): vanaf jaren 1950
cellijn = levende cellen welke aangelegd worden op de binnenwand van steriele glazen of plastic flessen of
buizen.
Cellijn is afkomstig van dierlijke of menselijke organen, fibroblasten of gemuteerde cellen: deze cellen worden
eerst behandeld met trypsine waardoor ze uiteen vallen in afzonderlijke cellen

Type cellijn:
 primaire cellijn: afkomstig van een dierlijk of menselijk orgaan
 continue cellijn: afkomstig van menselijke of dierlijke gemuteerde cellen (kankercellen) bv. HELA-cellijn
afkomstig van menselijke baarmoederhalskanker  voordeel: ongelimiteerd kweekbaar
 diploïde cellijn: cellijn afkomstig van fibroblastencellijn kunnen +/- 40 maal in vitro doorgekweekt worden

, Hoe beënten?
 patiëntenmateriaal bacterievrij maken door toevoegen van antibiotica of filtratie over een bacteriënfilter
 daarna de cellijn eventueel centrifugeren waardoor de eventueel aanwezige viruspartikels sneller in de
cellijn terecht komen
Hoe incuberen?
 Afhankelijk van het soort virus dat men verwacht te isoleren: meestal 37°C, gedurende 2-3 weken
Hoe nakijken op groei?
 enkele keren per week wordt de cellijn m.b.v. een omgekeerde microscoop onderzocht op aanwezigheid
van een CPE (cytopathogeen effect), zichtbaar door aanwezigheid van een “gat” in de cellijn (CPE is
zichtbaar als inclusies, vacuolisatie, veelkernige reuscellen, …)
 vorm van het CPE geeft een idee over het type virus
 bepaalde virussen groeien op bepaalde cellijnen en niet op andere cellijnen (“cellijnspecificiteit”)
Het soort (vorm) van het CPE , de snelheid van ontstaan van het CPE en het ontstaan van een op bepaalde
cellijnen  geeft een indicatie over het geïsoleerd virus

Evenwel zekerheidsdiagnose te stellen met: aankleuren van het CPE m.b.v. fluoresceïne gemerkte monoklonale
antistoffen gericht tegen het vermoedelijke virus (bekijken onder de fluorescentiemicroscoop)

Bemerkingen:
 soms groei in cellijn zonder vorming van een CPE
 groot gedeelte van virussen zijn nog niet kweekbaar in cellijnen
VOORDELEN NADELEN
- gevoelig - langzaam
- detecteert meerdere virussen - arbeidsintensief
- detecteert enkel levende virussen - verschillende cellijnen noodzakelijk
- detecteert niet alle virussen
- bepaalde virussen groeien in cellijn zonder vorming van CPE

Hoe diagnostiek versnellen ?
 centrifugatie van de cellijn na beënting
 niet wachten op het ontstaan van een CPE, maar reeds na 2 à 3 dagen kleuren met fluoresceïne gemerkte
monoklonale antistoffen
= versnelde viruskweek met IF zonder CPE na centrifugatie van beënte cellen
de versnelde viruskweek geeft een sneller antwoord en is gevoeliger dan de conventionele viruskweek maar men
vindt alleen wat men zoekt
Viruskweek:
VOORDEEL NADEEL
- diagnose na 24-48 uur - men vindt enkel wat men zoekt
- gevoelig
- specifiek door het gebruik van monoklonale antistoffen

Transport en bewaring van het klinische staal zijn cruciaal !!!
Transport:
- zo snel mogelijk , anders leefbaarheid virus daalt
- mengen met transport medium, transporteren op 4°C
Bewaren:
- indien noodzakelijk bij 4°C (zo kort mogelijk)
- bij -70°C (maar vriesdooi-cycli kunnen schade berokkenen)

- 1.3. Antigeen detectie = rechtstreekse detectie van virale antigenen in klinische stalen
o Immunofluorescentie (bv. RSV)
 kleuren van het klinisch staal met fluoresceïne gemerkte monoklonale antistoffen
gericht tegen antigenen van een bepaald virus
 bekijken onder de fluorescentiemicroscoop

, VOORDELEN NADELEN
- snel - ervaring vereist
- laat kwaliteitscontrole toe van het staal - wisselende gevoeligheid voor een aantal
- gevoelig voor sommige virussen (bv. virussen virussen
welke snel afsterven na afname staal!) - specificiteit: men vindt wat men zoekt

o Latexagglutinatie (bv. Rotavirus)
 het klinisch staal wordt in contact gebracht met latexpartikels bedekt met
monoklonale antistoffen gericht tegen antigenen van een bepaald virus
 agglutinatie visueel aflezen
o immunochromatografische methode (bv. Rotavirus)
 virale antigenen worden door chromatografie uit het klinisch staal gescheiden en worden in
contact gebracht met monoklonale antistoffen tegen deze virale antigenen zodanig dat een visuele
reactie afleesbaar wordt




Latexagglutinatie en immunochromatografische methode:
VOORDEEL NADEEL
- snel en eenvoudig - geen controle op kwaliteit van het staal
- prijs
- specificiteit: men vindt wat men zoekt

- 1.4. Genoomdetectie = detectie van viraal DNA of RNA
Hybridisatie: gebruik van probes gericht tegen een “specifiek” gedeelte van het genetisch materiaal van het
virus
gen-amplificatie: vermenigvuldiging van een “specifiek” gedeelte van het genetisch materiaal van het virus
gevolgd door detectie van het “amplicon”
o PCR-technieken
o kwantitatieve (real-time) PCR mogelijk: bepaling van “viral load” CT-waarde !!!!
 CT-waarde (cycle treshold): aantal cycli nodig om boven een vastgestelde detectiegrens te komen
 lage CT waarde geeft een hoge virale load weer
multiplex PCR
 detectie van verschillende virussen door gebruik te maken van verschillende primersets in 1 tube
 nadeel: beïnvloeding van de amplificatiereactie door te werken onder suboptimale condities met als
gevolg een lagere gevoeligheid
 o.a. respiratoir panel, gastro-intestinaal panel, encefalitis panel, …
 niet enkel beperkt voor de detectie van virussen, maar ook bacteriën, schimmels, parasieten, …
gen-amplificatie
 theoretisch: zéér gevoelige en zéér specifieke techniek
 in de praktijk: problemen van contaminatie (vals +) en aanwezigheid van inhibitoren in het klinisch
staal (vals - resultaten)




2. onrechtstreekse diagnose: aantonen van de immuunrespons (opsporen specifi eke anti stoff en)