Biologie – Klausur N°4
Genetischer Fingerabdruck
Def.: Eindeutige Identifikation von Individuen anhand individueller DNA
− Ein Genort wird betrachtet und die Wiederholungen bestimmter Basenabfolgen werden gezählt
=> Charakteristisch für jeweilige Individuum
Anwendung: Vaterschaftstest, Forensik, Verwandschaftsanalyse (Evolutionsforschung)
Polymerase-Kettenreaktion [PCR] = Vervielfältigung der DNA/Replikation von DNA-Stücken, ausgehend von einem einzigen Molekül
Ablauf: => wird 20-50-mal wiederholt Bestandteile:
I. Denaturierung: Auf 94 ℃ erhitzen => Wasserstoffbrücken werden getrennt
− Alle 4 Nukleotide der DNA
=> Doppelstrang wird in Einzelstränge zerlegt
− DNA-Polymerase [hitzestabil]
II. Hybridisierung: Bei 50-70 ℃ => Anlagerung des Primers an 3‘-Ende zum Start der
=> Taq-Polymerase [thermus aquaticus]
Synthese
III. Amplifikation: Bei 70 ℃ => Synthese; Nucleotide werden an die Einzelstränge − Primer [kurzes DNA-Stück]
angelagert, durch DNA-Polymerase entsteht der komplementäre Strang => Lässt sich, wenn Nukleotidsequenz der
DNA bekannt ist, chemisch herstellen
Funktioniert nicht? Primer/Polymerase bindet nicht, Denaturierung des Doppelstrangs, ... − DNA-Probe
25
Besonderheit: ausgehend von einem einzigen Molekül; Nach 25 PCR-Zyklen gibt es 2
Kopien
Gelelektrophorese
Analyse von Nucleinsäure- und Proteingemischen => Moleküle werden voneinander getrennt und können sichtbar gemacht werden
− Beruht auf unterschiedlich schnellen Wanderung v. geladenen Molekülen zwischen den Elektroden eines Gleichspannungsfeldes
=> Anionen (negative geladen) laufen zur positiven Anode, Kationen (positiv geladen) laufen zur negativen Kathode
− Gel wird als Trägermaterial verwendet => wirkt wie Netz, behindert die zu trennenden Moleküle bei ihrer Wanderung
=> meisten Agarose- oder Polyacrylamidgele
Vorgehen:
− DNA-Proben werden in Vertiefungen [Taschen] eines Gels gebracht
− DNA hat negativ geladene Phosphatgruppen => DNA-Fragmente wandern von Kathode zur Anode
− Je kürzer Fragmente sind, desto besser können sie durch Maschen des Gels durchdringen – Je länger, desto langsamer kommen sie
voran [Bremswirkung]
− Man lässt einen Farbstoff mitlaufen um Fortschreiten der Gelelektrophorese zu verfolgen
− Gleichlange DNA-Fragmente legen in bestimmter Zeit gleichlange Strecken zurück, haben die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit
=> liegen nach der Elektrophorese im Gel in Banden vor
− Sichtbar machen => fluoreszierende Reagenzien wie z.B. Ethidiumbromid werden hinzugegeben => DNA-Banden leuchten bei uv
Strahlung hell auf und werden sichtbar [oder mir radioaktiven Markern sichtbar machen]
Gensonden
− Ziel: Auffinden eines bestimmten Gens im Genom
− Voraussetzung: kleiner Teil der Basensequenz des Gens muss bekannt sein
Vorgehen:
− Kurze einsträngige DNA- oder RNA-Stücke , die komplementär zur Basensequenz sind werden hergestellt
=> lagern sich an das gesuchte Gen an
− Gensonden sind zur Identifizierung radioaktiv oder mit Fluoreszenzfarbstoff markiert
Herstellung von copy-DNA [cDNA] aus mRNA
Ziel: Gewinnung von cDNA, die als Spender-DNA oder Gensonde verwendet werden kann
Vorgehen
cDNA enthält nur Exons
− Reife RNA wird aus Zellen, in welchen gerade das gewünschte Gen abgelesen wird, isoliert
=> Eignet sich gut um eukaryotische
[nur Exons; nach Prozessierung + Transkription]
Gene in Bakterien einzusetzen, da diese
− Reverse Transkriptase ergänzt mRNA zu einem RNA-DNA-Hybrid-Doppelstrang
nicht fähig sind Introns zu entfernen
− Spalten des Hybrid-Stranges durch Denaturierung [z.B. Insulingen Plasmid-Technik]
− DNA-Einzelstrang wird mithilfe der DNA-Polymerase zum Doppelstrang
Genetischer Fingerabdruck
Def.: Eindeutige Identifikation von Individuen anhand individueller DNA
− Ein Genort wird betrachtet und die Wiederholungen bestimmter Basenabfolgen werden gezählt
=> Charakteristisch für jeweilige Individuum
Anwendung: Vaterschaftstest, Forensik, Verwandschaftsanalyse (Evolutionsforschung)
Polymerase-Kettenreaktion [PCR] = Vervielfältigung der DNA/Replikation von DNA-Stücken, ausgehend von einem einzigen Molekül
Ablauf: => wird 20-50-mal wiederholt Bestandteile:
I. Denaturierung: Auf 94 ℃ erhitzen => Wasserstoffbrücken werden getrennt
− Alle 4 Nukleotide der DNA
=> Doppelstrang wird in Einzelstränge zerlegt
− DNA-Polymerase [hitzestabil]
II. Hybridisierung: Bei 50-70 ℃ => Anlagerung des Primers an 3‘-Ende zum Start der
=> Taq-Polymerase [thermus aquaticus]
Synthese
III. Amplifikation: Bei 70 ℃ => Synthese; Nucleotide werden an die Einzelstränge − Primer [kurzes DNA-Stück]
angelagert, durch DNA-Polymerase entsteht der komplementäre Strang => Lässt sich, wenn Nukleotidsequenz der
DNA bekannt ist, chemisch herstellen
Funktioniert nicht? Primer/Polymerase bindet nicht, Denaturierung des Doppelstrangs, ... − DNA-Probe
25
Besonderheit: ausgehend von einem einzigen Molekül; Nach 25 PCR-Zyklen gibt es 2
Kopien
Gelelektrophorese
Analyse von Nucleinsäure- und Proteingemischen => Moleküle werden voneinander getrennt und können sichtbar gemacht werden
− Beruht auf unterschiedlich schnellen Wanderung v. geladenen Molekülen zwischen den Elektroden eines Gleichspannungsfeldes
=> Anionen (negative geladen) laufen zur positiven Anode, Kationen (positiv geladen) laufen zur negativen Kathode
− Gel wird als Trägermaterial verwendet => wirkt wie Netz, behindert die zu trennenden Moleküle bei ihrer Wanderung
=> meisten Agarose- oder Polyacrylamidgele
Vorgehen:
− DNA-Proben werden in Vertiefungen [Taschen] eines Gels gebracht
− DNA hat negativ geladene Phosphatgruppen => DNA-Fragmente wandern von Kathode zur Anode
− Je kürzer Fragmente sind, desto besser können sie durch Maschen des Gels durchdringen – Je länger, desto langsamer kommen sie
voran [Bremswirkung]
− Man lässt einen Farbstoff mitlaufen um Fortschreiten der Gelelektrophorese zu verfolgen
− Gleichlange DNA-Fragmente legen in bestimmter Zeit gleichlange Strecken zurück, haben die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit
=> liegen nach der Elektrophorese im Gel in Banden vor
− Sichtbar machen => fluoreszierende Reagenzien wie z.B. Ethidiumbromid werden hinzugegeben => DNA-Banden leuchten bei uv
Strahlung hell auf und werden sichtbar [oder mir radioaktiven Markern sichtbar machen]
Gensonden
− Ziel: Auffinden eines bestimmten Gens im Genom
− Voraussetzung: kleiner Teil der Basensequenz des Gens muss bekannt sein
Vorgehen:
− Kurze einsträngige DNA- oder RNA-Stücke , die komplementär zur Basensequenz sind werden hergestellt
=> lagern sich an das gesuchte Gen an
− Gensonden sind zur Identifizierung radioaktiv oder mit Fluoreszenzfarbstoff markiert
Herstellung von copy-DNA [cDNA] aus mRNA
Ziel: Gewinnung von cDNA, die als Spender-DNA oder Gensonde verwendet werden kann
Vorgehen
cDNA enthält nur Exons
− Reife RNA wird aus Zellen, in welchen gerade das gewünschte Gen abgelesen wird, isoliert
=> Eignet sich gut um eukaryotische
[nur Exons; nach Prozessierung + Transkription]
Gene in Bakterien einzusetzen, da diese
− Reverse Transkriptase ergänzt mRNA zu einem RNA-DNA-Hybrid-Doppelstrang
nicht fähig sind Introns zu entfernen
− Spalten des Hybrid-Stranges durch Denaturierung [z.B. Insulingen Plasmid-Technik]
− DNA-Einzelstrang wird mithilfe der DNA-Polymerase zum Doppelstrang
