HOOFDSTUK 1: ANALYSE VAN RNA
RNA VOORZORGEN EN BEWAREN
1) Problemen
→ Staalname => verandering RNA profiel
→ RNA degradatie > endogeen/ exogeen (RNAse)
→ DNA contaminatie
2) Staalname
→ Anticoagulans = EDTA (niet heparine > inhibitie)
→ RNA stabilisatie
− Invriezen in N
− Bewaarmiddel = PAXgene (bloed), RNAlater (cel), Trizol (weefsel)
3) Staalverwerking/ bewaring
→ RNAse vrij => DEPC (carcinogeen), andere inhibitoren
→ Nuclease vrije oplossingen
→ 1 jaar op -80°C
→ Langer: alcoholprecipitaat
4) DNA contaminatie
→ Enkel probleem als onderscheid nodig is
→ Detectie = RT – controle/ elektroforese
→ Verwijderen: DNAse behandeling => verlies RNA mogelijk
RNA EXTRAHEREN
→ Afh v startmateriaal en doel
1) Lysis => °lysaat
→ Remmers ongewenste moleculen
→ Detergenten
→ Vriezen en ontdooien => cryopreservatie nodig
→ Mechanisch: pestel/ beads
→ Vloeibaar: glazen pestels, mild, organellen intact
→ Sonicatie: DNA/RNA mee fragmenteren
2) Isoleren => RNA uit lysaat halen
→ Organische solventen = trizol
− Zuur => breekt DNA af
− Guanidium thiocyanaat => lysis + inhibitie RNAse
− Goede opbrengst + zuiverheid
→ Alcoholprecipitatie => RNA uit waterlaag
− Zout (Na-acetaat) + alcohol (ethanol/isopropanol) => neerslaan RNA
− Terug oplossen in water/ buffer
− Lage conc => lage T/ glycogeen toevoegen
→ Kolomchromatografie => RNA uit waterlaag
− Silica kolom: selectieve binding RNA > buffer
− Elutie > water/ buffer
− Goede zuiverheid <-> beperkte opbrengst
− Chaotrope zouten in buffer => nuclease inhibitie
, 3) Oplossen => gewenste hoeveelheid
→ Alcoholprecipitatie/ kolom => ook opzuiveren
→ Concentrators
− Centrifugatie door filter volgens grootte
− Geen zout toevoeging
− Max capaciteit: te veel => verstopping
→ Speedvac
− Verdamping solvent
− Zouten/ onzuiverheden niet weg
RNA KWANTIFICEREN
→ Inschatting opbrengst
→ Te laag => onvoldoende input
→ Te hoog => inhibitie/ saturatie
Spectrofotometrie Absorptie licht door RNA (260nm)
Aspecifiek, overschatting, geen onderscheid DNA/RNA
Wet Lambert-Beer => hoeveelheid RNA
Miniatuur = nanodrop
RNA > DNA absorberen
A260/280 < 2 => eiwitcontaminatie
A260/230 < 2 => zoutcontaminatie
Fluorimetrie Binding moleculen (ribogreen)
Selectief voor RNA, nauwkeurig, gevoelig
Omslachtig, licht/T-gevoelig
Lage concentraties
Elektroforese Scheiding RNA obv grootte
Concentratie, intactheid, lengte
(semi)kwantitatief
Agarose
→ Kan denaturerend
→ Totaal EU RNA = 28S en 18S bandje
→ gDNA contaminatie => hoog bandje
→ geen mRNA detecteren
Capillair
→ fluo kleurstof gebruiken
→ concentratie bepaling
→ RIN = 10 => volledig intact
→ RIN > 7 => NGS mogelijk
,RNA IN VITRO AANMAKEN
→ Bestuderen: RNA structuur/ eiwit-interacties
1) Chemisch = keten NTers maken => korte RNAs
2) Enymatisch = TXN
→ Polymerasen
− 5->3 elongatie
− Coderende streng = sense = positief
− Template streng = anti sense = negatief
− Uit bacteriofagen
→ DNA template
− Plasmide, PCR fragment, cDNA
− Terminatie = signaal/ einde fragment
− Initiatie: promotor/ in plasmide/ adaptor toegevoegd
RNA REVERSE TRANSCRIPTIE
→ In vivo: rerto virussen, telomerasen
In vitro: RNA -> cDNA => verder onderzoek
→ Buffer: DTT, RNAse inhibitor & ionen
geen herhaling van stappen!
Korte primer => lage T
1) Reverse transcriptase (uit virussen)
→ 5->3 DNA polymerase
→ RNAseH activiteit
− RNA-cDNA hybriden afbreken
− Bij aanmaak 2e streng nodig
− Beperkt lengte van cDNA
− RNAseH- voor lang cDNA
→ Te hoge T => denaturatie sec structuur, GC rijke template nodig
→ Geen amplificatie fouten
→ TdT activiteit => 3’ NT toevoegen (voor RNA seq)
2) Primers
→ Oligo dT
− Complement aan poly A staart
− Volledige lengte cDNA
− Enkel mRNA
− 3’bias > bij lang RNA/ sec structuur stopt TXN => minder 5’ eindes TXN
→ Random hexameren
− Efficiënt, voor al het RNA
− Gelijke vertegenwoordiging alle fragmenten
− Geen volledige lengte cDNA
, → Gen specifiek
− Moeilijk toepasbaar voor genen tegelijk
− Moeilijk voor weinig abundante genen
− Combinatie met qPCR
→ Bijzondere toepassingen
− Combinatie primers
− miRNA TXN
3) cDNA kloneren
→ expressievectoren maken
→ cDNA bib maken
→ dubbelstrengs cDNA nodig: RT (+PCR)
Blunt end
Niet directioneel oligo dT primer
Directioneel extra sequentie toevoegen
-> restrictie site
-> homologe recombinatie site
-> promotor voor TXN
Blauw = adaptor
Groen = primer
Ligatie onafhankelijk geen RE en ligatie
Niet directioneel TdT => C aan 3’ toevoegen
RNA VOORZORGEN EN BEWAREN
1) Problemen
→ Staalname => verandering RNA profiel
→ RNA degradatie > endogeen/ exogeen (RNAse)
→ DNA contaminatie
2) Staalname
→ Anticoagulans = EDTA (niet heparine > inhibitie)
→ RNA stabilisatie
− Invriezen in N
− Bewaarmiddel = PAXgene (bloed), RNAlater (cel), Trizol (weefsel)
3) Staalverwerking/ bewaring
→ RNAse vrij => DEPC (carcinogeen), andere inhibitoren
→ Nuclease vrije oplossingen
→ 1 jaar op -80°C
→ Langer: alcoholprecipitaat
4) DNA contaminatie
→ Enkel probleem als onderscheid nodig is
→ Detectie = RT – controle/ elektroforese
→ Verwijderen: DNAse behandeling => verlies RNA mogelijk
RNA EXTRAHEREN
→ Afh v startmateriaal en doel
1) Lysis => °lysaat
→ Remmers ongewenste moleculen
→ Detergenten
→ Vriezen en ontdooien => cryopreservatie nodig
→ Mechanisch: pestel/ beads
→ Vloeibaar: glazen pestels, mild, organellen intact
→ Sonicatie: DNA/RNA mee fragmenteren
2) Isoleren => RNA uit lysaat halen
→ Organische solventen = trizol
− Zuur => breekt DNA af
− Guanidium thiocyanaat => lysis + inhibitie RNAse
− Goede opbrengst + zuiverheid
→ Alcoholprecipitatie => RNA uit waterlaag
− Zout (Na-acetaat) + alcohol (ethanol/isopropanol) => neerslaan RNA
− Terug oplossen in water/ buffer
− Lage conc => lage T/ glycogeen toevoegen
→ Kolomchromatografie => RNA uit waterlaag
− Silica kolom: selectieve binding RNA > buffer
− Elutie > water/ buffer
− Goede zuiverheid <-> beperkte opbrengst
− Chaotrope zouten in buffer => nuclease inhibitie
, 3) Oplossen => gewenste hoeveelheid
→ Alcoholprecipitatie/ kolom => ook opzuiveren
→ Concentrators
− Centrifugatie door filter volgens grootte
− Geen zout toevoeging
− Max capaciteit: te veel => verstopping
→ Speedvac
− Verdamping solvent
− Zouten/ onzuiverheden niet weg
RNA KWANTIFICEREN
→ Inschatting opbrengst
→ Te laag => onvoldoende input
→ Te hoog => inhibitie/ saturatie
Spectrofotometrie Absorptie licht door RNA (260nm)
Aspecifiek, overschatting, geen onderscheid DNA/RNA
Wet Lambert-Beer => hoeveelheid RNA
Miniatuur = nanodrop
RNA > DNA absorberen
A260/280 < 2 => eiwitcontaminatie
A260/230 < 2 => zoutcontaminatie
Fluorimetrie Binding moleculen (ribogreen)
Selectief voor RNA, nauwkeurig, gevoelig
Omslachtig, licht/T-gevoelig
Lage concentraties
Elektroforese Scheiding RNA obv grootte
Concentratie, intactheid, lengte
(semi)kwantitatief
Agarose
→ Kan denaturerend
→ Totaal EU RNA = 28S en 18S bandje
→ gDNA contaminatie => hoog bandje
→ geen mRNA detecteren
Capillair
→ fluo kleurstof gebruiken
→ concentratie bepaling
→ RIN = 10 => volledig intact
→ RIN > 7 => NGS mogelijk
,RNA IN VITRO AANMAKEN
→ Bestuderen: RNA structuur/ eiwit-interacties
1) Chemisch = keten NTers maken => korte RNAs
2) Enymatisch = TXN
→ Polymerasen
− 5->3 elongatie
− Coderende streng = sense = positief
− Template streng = anti sense = negatief
− Uit bacteriofagen
→ DNA template
− Plasmide, PCR fragment, cDNA
− Terminatie = signaal/ einde fragment
− Initiatie: promotor/ in plasmide/ adaptor toegevoegd
RNA REVERSE TRANSCRIPTIE
→ In vivo: rerto virussen, telomerasen
In vitro: RNA -> cDNA => verder onderzoek
→ Buffer: DTT, RNAse inhibitor & ionen
geen herhaling van stappen!
Korte primer => lage T
1) Reverse transcriptase (uit virussen)
→ 5->3 DNA polymerase
→ RNAseH activiteit
− RNA-cDNA hybriden afbreken
− Bij aanmaak 2e streng nodig
− Beperkt lengte van cDNA
− RNAseH- voor lang cDNA
→ Te hoge T => denaturatie sec structuur, GC rijke template nodig
→ Geen amplificatie fouten
→ TdT activiteit => 3’ NT toevoegen (voor RNA seq)
2) Primers
→ Oligo dT
− Complement aan poly A staart
− Volledige lengte cDNA
− Enkel mRNA
− 3’bias > bij lang RNA/ sec structuur stopt TXN => minder 5’ eindes TXN
→ Random hexameren
− Efficiënt, voor al het RNA
− Gelijke vertegenwoordiging alle fragmenten
− Geen volledige lengte cDNA
, → Gen specifiek
− Moeilijk toepasbaar voor genen tegelijk
− Moeilijk voor weinig abundante genen
− Combinatie met qPCR
→ Bijzondere toepassingen
− Combinatie primers
− miRNA TXN
3) cDNA kloneren
→ expressievectoren maken
→ cDNA bib maken
→ dubbelstrengs cDNA nodig: RT (+PCR)
Blunt end
Niet directioneel oligo dT primer
Directioneel extra sequentie toevoegen
-> restrictie site
-> homologe recombinatie site
-> promotor voor TXN
Blauw = adaptor
Groen = primer
Ligatie onafhankelijk geen RE en ligatie
Niet directioneel TdT => C aan 3’ toevoegen
