Celbiologie II
H1: SORTEREN VAN EIWITTEN
1.1 SORTEREN NAAR MITOCHONDRIËN
1.1.1 Structuur en functie mitochondriën
- dubbel membraan: buitenste (BUM) -> poriën, doorlaatbaar voor kleine moleculen
binnenste (BIM) -> cardiolipine, volledig ondoorlaatbaar
- eigen DNA
- functie in metabolisme: afbraak vetzuren en glucose, Krebscyclus, stikstofmetabolisme en geprogrammeerde celdood
1.1.2 Eiwitten bestemd voor mitochondriale matrix
signaalsequentie: - N-terminus
- 20-50 AZ’en + hydrofobe-/pos. geladen-/basisiche-/gehydroxyleerde AZ’en
enkel ongevouwen eiwitten geïmporteerd -> gebonden aan chaperone (bv. hsp70)
1. signaalsequentie bindt aan Tom eiwit (= importreceptor in BUM, translocon of outer membrane) --> eiwit nr importkanaal (Tom40)
2. eiwit getransloceerd door kanaal in BIM (Tim eiwit)
3. eiwit bereikt matrix --> afgesplitst door protease
4. eiwit gevouwen (event. m.b.v. chaperonine)
energie nodig op 3 plaatsen:
- binding aan chaperone in cytosol
- binding aan chaperone in mito. matrix
- generatie elektrochemische gradiënt (door neg. matrix wordt pos. signaalsequentie naar binnen getrokken)
1.1.2 Eiwitten bestemd voor andere mitochondriale compartimenten
- import in BUM: eiwit tegengehouden in Tom40 kanaal en beweegt vervolgens lateraal
- import in intermembranaire ruimte: eiwit migreert enkel door kanaal BUM en komt dan vrij
- import in BIM: eiwit migreert door kanaal in BUM en BIM (bevat naast signaal-, hydrofobe seq. -> weerhoudt eiwit in BIM)
- import in matrix en na afsplitsing signaalsequentie terug migreren naar BIM of intermembranaire ruimte
Pathologie:
mutatie targeting signaal DNA herstel enzym OGG --> komt niet meer in mito. terecht --> kanker
1.2 SORTEREN NAAR PEROXISOMEN
1.2.1 Structuur
- enkelvoudig membraan
- in alle eukaryote cellen behalve RBC
- gelijkaardig aan glyoxysomen (in Trypanosoma) en glycosomen (in planten)
1.2.2 Functie
< oxidasen (produceren H2O2) en catalase (inactiveert H2O2)
lipidenmetabolisme:
- β-oxidatie: omzetting cholesterol naar galzouten
- α-oxidatie: afsplitsing 1C vertakte vetzuren, voorafgaand aan β-oxidatie
- synthese etherfosolipiden
1.2.3 Eiwitten bestemd voor peroxisomale matrix
1. synthese op polyribosomen in cytosol
---> signaalsequentie: PTS1 signaal: C-terminaal, wordt niet afgesplitst (serine-lysine-leucine (SKL) of geconserveerde variant)
PTS2 signaal: N-terminaal, kan afgesplitst worden
2. cytosolische receptoren herkennen signaalseq. --> eiwit naar peroxisomale membraan
3. translocatie doorheen peroxisomale membraan, afsplitsen peroxisomale matrix eiwit en recyclage receptoren
- eiwitten kunnen in gevouwen toestand worden geïmporteerd
- betrokken eiwitten = peroxines (Pex) (14 verschillende bekend bij de mens)
- importproces is ATP afhankelijk
1.2.4 Eiwitten bestemd voor peroxisomale membraan
via andere signalen, niet verder besproken
Pathologie: Peroxisoom biogenese ziekten
oorzaak: mutatie Pex genen
gevolg: peroxisomale eiwitten zijn ectopisch gelokaliseerd in cytosol (opstapeling substraten β-oxidatie en tekort etherfosolipiden)
ziektebeeld ‘Cerebro-hepato-renaal syndroom van Zellweger’: hyptonie bij geboorte, dysgenese hersengebieden,
psychomotorische retardatie, dysmorfie aangezicht, niercysten, leverfibrose en dood binnen 6 maanden
1
, 1.3 TRANSPORT NAAR EN VAN DE KERN
- nucleaire enveloppe < nuclear pore complexes (NPC) < nucleoporines (eiwitten)
- regelmatige octagonale vorm/’nuclear basket’: acht filamenten samengehouden door ring
- moleculen < 60 kDa kunnen diffunderen door kanaal in NPC, grotere eiwitten -> transportsystemen nodig
1.3.1 Transport van cytosol naar kern
- eiwitten bestemd voor kern < nuclear localisatie signaal (NLS) < kort domein basische AZ’en
1. NLS-eiwit gebonden door importin eiwit
2. complex migreert door NPC door interactie met opeenvolgende nucleoporines
3. in nucleoplasma: complex bindt aan Ran-GTP (Ran = klein G proteïne, kan GTP en GDP gebonden zijn) --> eiwit komt vrij
4. importin-Ran-GTP complex gerecycleerd - cytosol: GTP naar GDP --> importin vrij
- Ran-GDP naar nucleoplasma: Ran-GEF --> vervangt GDP door GTP
1.3.2 Transport van kern naar cytosol
- nucleaire exportsignalen (NES) < leucine rijke- of nog onbekende sequenties
1. NES-eiwit gebonden door exportin eiwit en Ran-GTP
2. complex diffundeert door NPC door interactie met opeenvolgende nucleoporines
3. cytosolische zijde: Ran-GAP --> Ran-GTP naar Ran-GDP --> eiwit komt vrij
4. exportin-Ran-GDP complex gerecycleerd: nucleus: Ran-GEF --> vervangt GDP door GTP
- export mRNPs (mRNA moleculen gebonden aan eiwitten) uit kern door binding aan mRNA exporter proteïne
- eenrichtingstransport verzekerd door lokalisatie Ran-GEF (in kern) en Ran-GAP (in cytosol)
Pathologie:
import/export systeem betrokken bij ALS (amyotrofe lateraal sclerose) en ontwikkeling GM tegen AIDS
Experimentele procedures om signaalsequenties te identificeren:
- plasmiden die cDNA code voor te importeren eiwit bevatten + code voor reportereiwit (eiwit met makkelijk te bepalen locatie)
- meestal gebruik groen fluorescerend proteïne (GFP)
--> aantonen of bepaalde sequentie ‘noodzakelijk’ is voor correcte lokalisatie van eiwit
- signaalseq. fusioneren met reportereiwit, indien seq. eiwit naar peroxisomen brengt
--> aangetoond dat SKL sequentie ‘voldoende’ is als signaal voor peroxisomale lokalisatie
1.4 DE SECRETORISCHE WEG
1.4.1 Oplosbare eiwitten
- N-terminale signaalsequentie < 1/+ pos. AZ’en en 6-12 hydrofobe AZ’en
cotranslationeel transport*:
1. signaalseq. gesynthetiseerd tijdens translatie op cytosolisch ribosoom
2. signaalseq. herkend door Signal Recognition Particle (SRP) -> translatie stopt
3. complex naar ER membraan: SRP bindt aan SRP receptor
4. SRP afgesplitst, recycleert naar cytosol en eiwitsynthese gaat verder
5. (*terwijl translatie) eiwit getranslokeerd naar lumen van ER
6. protease splitst signaalseq. af
1.4.2 Insertie van eiwitten in membraan (ER, Golgi, Lysosomen en plasmamembraan)
eiwitten gesynthetiseerd op RER -> geïntegreerd in membraan -> oriëntatie in membraan behouden tijdens weg doorheen cel
(Geïntegreerde/Integrale membraanproteïnen ingedeeld volgens topologie:)
(hydropathie profielen -> membraanspannende regio’s opsporen en topologie voorspellen)
1.4.2.1 Type I eiwitten
< N-terminale signaalseq. + interne hydrofobe seq. (= stop transfer anker seq.) --> gebruikt cotranslationeel transport
1.4.2.2 Type II en III eiwitten
< geen N-terminale signaalseq., maar één interne hydrofobe seq. (functioneert als signaal- en membraananker seq.)
Type II: - translatie, synthese interne signaalseq. -> bindt aan SRP en migreert naar ER -> bindt aan translocatiekanaal
--> N-terminus naar cytosol gericht en aangroeiende C-terminus getranslokeerd in lumen
Type III: - signaalanker seq. dicht bij N-terminus --> N-terminus naar lumen gericht en C-terminus naar cytosolische zijde
1.4.2.3 Type IV eiwitten: multipass eiwitten
< meerdere hydrofobe domeinen (functioneren als interne signaalseq. of stop transfer-anker seq.)
- binding 1ste α-helix aan ER membraan
- groeiende keten translokeerd door kanaal tot 2de membraanspannende domein aangemaakt (stop transfer-anker seq.)
- translatie gaat verder tot 3de domein aangemaakt (signaal-anker seq.) en 4de (stop-anker seq.)
1.4.2.4 GPI verankerde eiwitten
< afsplitsbaar N-terminaal signaal en intern hydrofoob domein
-> enzym in ER splitst hydrofobe seq. af en transfereert rest naar GPI (glycosylphosphatidylinositol)
(voordeel: eiwit meer beweeglijk t.o.v. eiwitten met membraanspannende domeinen)
2
H1: SORTEREN VAN EIWITTEN
1.1 SORTEREN NAAR MITOCHONDRIËN
1.1.1 Structuur en functie mitochondriën
- dubbel membraan: buitenste (BUM) -> poriën, doorlaatbaar voor kleine moleculen
binnenste (BIM) -> cardiolipine, volledig ondoorlaatbaar
- eigen DNA
- functie in metabolisme: afbraak vetzuren en glucose, Krebscyclus, stikstofmetabolisme en geprogrammeerde celdood
1.1.2 Eiwitten bestemd voor mitochondriale matrix
signaalsequentie: - N-terminus
- 20-50 AZ’en + hydrofobe-/pos. geladen-/basisiche-/gehydroxyleerde AZ’en
enkel ongevouwen eiwitten geïmporteerd -> gebonden aan chaperone (bv. hsp70)
1. signaalsequentie bindt aan Tom eiwit (= importreceptor in BUM, translocon of outer membrane) --> eiwit nr importkanaal (Tom40)
2. eiwit getransloceerd door kanaal in BIM (Tim eiwit)
3. eiwit bereikt matrix --> afgesplitst door protease
4. eiwit gevouwen (event. m.b.v. chaperonine)
energie nodig op 3 plaatsen:
- binding aan chaperone in cytosol
- binding aan chaperone in mito. matrix
- generatie elektrochemische gradiënt (door neg. matrix wordt pos. signaalsequentie naar binnen getrokken)
1.1.2 Eiwitten bestemd voor andere mitochondriale compartimenten
- import in BUM: eiwit tegengehouden in Tom40 kanaal en beweegt vervolgens lateraal
- import in intermembranaire ruimte: eiwit migreert enkel door kanaal BUM en komt dan vrij
- import in BIM: eiwit migreert door kanaal in BUM en BIM (bevat naast signaal-, hydrofobe seq. -> weerhoudt eiwit in BIM)
- import in matrix en na afsplitsing signaalsequentie terug migreren naar BIM of intermembranaire ruimte
Pathologie:
mutatie targeting signaal DNA herstel enzym OGG --> komt niet meer in mito. terecht --> kanker
1.2 SORTEREN NAAR PEROXISOMEN
1.2.1 Structuur
- enkelvoudig membraan
- in alle eukaryote cellen behalve RBC
- gelijkaardig aan glyoxysomen (in Trypanosoma) en glycosomen (in planten)
1.2.2 Functie
< oxidasen (produceren H2O2) en catalase (inactiveert H2O2)
lipidenmetabolisme:
- β-oxidatie: omzetting cholesterol naar galzouten
- α-oxidatie: afsplitsing 1C vertakte vetzuren, voorafgaand aan β-oxidatie
- synthese etherfosolipiden
1.2.3 Eiwitten bestemd voor peroxisomale matrix
1. synthese op polyribosomen in cytosol
---> signaalsequentie: PTS1 signaal: C-terminaal, wordt niet afgesplitst (serine-lysine-leucine (SKL) of geconserveerde variant)
PTS2 signaal: N-terminaal, kan afgesplitst worden
2. cytosolische receptoren herkennen signaalseq. --> eiwit naar peroxisomale membraan
3. translocatie doorheen peroxisomale membraan, afsplitsen peroxisomale matrix eiwit en recyclage receptoren
- eiwitten kunnen in gevouwen toestand worden geïmporteerd
- betrokken eiwitten = peroxines (Pex) (14 verschillende bekend bij de mens)
- importproces is ATP afhankelijk
1.2.4 Eiwitten bestemd voor peroxisomale membraan
via andere signalen, niet verder besproken
Pathologie: Peroxisoom biogenese ziekten
oorzaak: mutatie Pex genen
gevolg: peroxisomale eiwitten zijn ectopisch gelokaliseerd in cytosol (opstapeling substraten β-oxidatie en tekort etherfosolipiden)
ziektebeeld ‘Cerebro-hepato-renaal syndroom van Zellweger’: hyptonie bij geboorte, dysgenese hersengebieden,
psychomotorische retardatie, dysmorfie aangezicht, niercysten, leverfibrose en dood binnen 6 maanden
1
, 1.3 TRANSPORT NAAR EN VAN DE KERN
- nucleaire enveloppe < nuclear pore complexes (NPC) < nucleoporines (eiwitten)
- regelmatige octagonale vorm/’nuclear basket’: acht filamenten samengehouden door ring
- moleculen < 60 kDa kunnen diffunderen door kanaal in NPC, grotere eiwitten -> transportsystemen nodig
1.3.1 Transport van cytosol naar kern
- eiwitten bestemd voor kern < nuclear localisatie signaal (NLS) < kort domein basische AZ’en
1. NLS-eiwit gebonden door importin eiwit
2. complex migreert door NPC door interactie met opeenvolgende nucleoporines
3. in nucleoplasma: complex bindt aan Ran-GTP (Ran = klein G proteïne, kan GTP en GDP gebonden zijn) --> eiwit komt vrij
4. importin-Ran-GTP complex gerecycleerd - cytosol: GTP naar GDP --> importin vrij
- Ran-GDP naar nucleoplasma: Ran-GEF --> vervangt GDP door GTP
1.3.2 Transport van kern naar cytosol
- nucleaire exportsignalen (NES) < leucine rijke- of nog onbekende sequenties
1. NES-eiwit gebonden door exportin eiwit en Ran-GTP
2. complex diffundeert door NPC door interactie met opeenvolgende nucleoporines
3. cytosolische zijde: Ran-GAP --> Ran-GTP naar Ran-GDP --> eiwit komt vrij
4. exportin-Ran-GDP complex gerecycleerd: nucleus: Ran-GEF --> vervangt GDP door GTP
- export mRNPs (mRNA moleculen gebonden aan eiwitten) uit kern door binding aan mRNA exporter proteïne
- eenrichtingstransport verzekerd door lokalisatie Ran-GEF (in kern) en Ran-GAP (in cytosol)
Pathologie:
import/export systeem betrokken bij ALS (amyotrofe lateraal sclerose) en ontwikkeling GM tegen AIDS
Experimentele procedures om signaalsequenties te identificeren:
- plasmiden die cDNA code voor te importeren eiwit bevatten + code voor reportereiwit (eiwit met makkelijk te bepalen locatie)
- meestal gebruik groen fluorescerend proteïne (GFP)
--> aantonen of bepaalde sequentie ‘noodzakelijk’ is voor correcte lokalisatie van eiwit
- signaalseq. fusioneren met reportereiwit, indien seq. eiwit naar peroxisomen brengt
--> aangetoond dat SKL sequentie ‘voldoende’ is als signaal voor peroxisomale lokalisatie
1.4 DE SECRETORISCHE WEG
1.4.1 Oplosbare eiwitten
- N-terminale signaalsequentie < 1/+ pos. AZ’en en 6-12 hydrofobe AZ’en
cotranslationeel transport*:
1. signaalseq. gesynthetiseerd tijdens translatie op cytosolisch ribosoom
2. signaalseq. herkend door Signal Recognition Particle (SRP) -> translatie stopt
3. complex naar ER membraan: SRP bindt aan SRP receptor
4. SRP afgesplitst, recycleert naar cytosol en eiwitsynthese gaat verder
5. (*terwijl translatie) eiwit getranslokeerd naar lumen van ER
6. protease splitst signaalseq. af
1.4.2 Insertie van eiwitten in membraan (ER, Golgi, Lysosomen en plasmamembraan)
eiwitten gesynthetiseerd op RER -> geïntegreerd in membraan -> oriëntatie in membraan behouden tijdens weg doorheen cel
(Geïntegreerde/Integrale membraanproteïnen ingedeeld volgens topologie:)
(hydropathie profielen -> membraanspannende regio’s opsporen en topologie voorspellen)
1.4.2.1 Type I eiwitten
< N-terminale signaalseq. + interne hydrofobe seq. (= stop transfer anker seq.) --> gebruikt cotranslationeel transport
1.4.2.2 Type II en III eiwitten
< geen N-terminale signaalseq., maar één interne hydrofobe seq. (functioneert als signaal- en membraananker seq.)
Type II: - translatie, synthese interne signaalseq. -> bindt aan SRP en migreert naar ER -> bindt aan translocatiekanaal
--> N-terminus naar cytosol gericht en aangroeiende C-terminus getranslokeerd in lumen
Type III: - signaalanker seq. dicht bij N-terminus --> N-terminus naar lumen gericht en C-terminus naar cytosolische zijde
1.4.2.3 Type IV eiwitten: multipass eiwitten
< meerdere hydrofobe domeinen (functioneren als interne signaalseq. of stop transfer-anker seq.)
- binding 1ste α-helix aan ER membraan
- groeiende keten translokeerd door kanaal tot 2de membraanspannende domein aangemaakt (stop transfer-anker seq.)
- translatie gaat verder tot 3de domein aangemaakt (signaal-anker seq.) en 4de (stop-anker seq.)
1.4.2.4 GPI verankerde eiwitten
< afsplitsbaar N-terminaal signaal en intern hydrofoob domein
-> enzym in ER splitst hydrofobe seq. af en transfereert rest naar GPI (glycosylphosphatidylinositol)
(voordeel: eiwit meer beweeglijk t.o.v. eiwitten met membraanspannende domeinen)
2
