SV Omica en bio-informatica Dries Vrindts
Samenvatting omica en bio-informatica
Omica
Hoofdstuk 1: Next-generation sequensing methodes
- Generaties
o Eerste: Maxam-Gilbert (radioactieve labeling) en Sanger sequencing (ddNTP’s)
o Tweede: Korte DNA-fragmenten, bv. Pyrosequencing, semiconductor sequencing en
sequencing by synthesis
o Derde: Lange DNA-fragmenten → single molecule methodes, bv. Pacific Biosciences en Oxford
Nanopore Technologies
- Input-DNA moet hoog moleculair gewicht zijn, vrij van RNA, hoge zuiverheid en hoge concentratie
- Nanodrop (spectrofotometrie) gebruiken om zuiverheid na te gaan, Fluorometrie om concentratie te
bepalen met behulp van intercallating agent (verschil in fluorescentie tussen gebonden en niet-
gebonden molecule)
Tweede generatie sequencing
- DNA-fragmentatie nodig om bepaalde lengte van DNA-fragmenten te bekomen
o Enzymatische lyse: gebruik van verschillende restrictie-enzymen om fragmenten te creëren,
tijdsduur van werking aanpassen om bepaalde grootte van fragmenten te bekomen
o Covaris: ultrasone golven worden geconcentreerd in bepaalde positie in waterbad waar epje
met DNA kan geplaatst worden voor fragmentatie → kleiner wattage dan bij sonicatie over heel
bad, dus minder opwarming
o Verneveling (nebulisatie): Staal vernevelen in speciaal toestel om kleinere fragmenten te
krijgen
o HydroShear: hydrodynamische krachten gebruiken om DNA-oplossing heen en weer te sturen
doorheen membraan, pompsnelheid optimaliseren per staal(soort) om gewenste lengte te
verkrijgen
- Capilaire elektroforese
o Als kwaliteitscontrole van staal alvorens te sequeneren
o Op microfluidica = chip met verschillende wells voor staal
en gels voor elektroforese → bevat separtion channel waar
ook detectie gebeurt
o Range van detectie tussen 35 en 10380 bp
o Staal bevat veel fragmenten met veel verschillende lengtes
waarbij ook 35 en 10380 bp-fragmenten worden gespiked
om resultaten te ijken na elektroforese
- Fragmentselectie
o E-gel SizeSelect: Gel met twee rijen welletjes waar in één rij stalen en ladder worden geladen
waarna de stalen naar de tweede rij lopen, als ladder met door tweede well is gemigreerd en
juiste range van ladder rond de well ligt (onder kort, boven lang fragment) kan staal uit andere
wells worden gehaald waardoor dit de juiste range van lengte bevat
o Pippin systeem: automatische scheiding op grote van het DNA door staal te laten lopen door
kanaal met detectie van de lengte, bij juiste range van lengte wordt DNA gescheiden in apart
kanaal dat terug zal afgesloten worden als alle fragmenten van juiste lengte zijn afgezonderd
Pyrosequencing (454 sequencing)
1
,SV Omica en bio-informatica Dries Vrindts
- Principe: sequencing by synthesis → sequencing via synthese met PCR met template en primers
waarbij lichtsignaal wordt vrijgegeven
- Roche: verbeterde techniek van low througput naar high throughput (meerdere stalen tegelijk)
- Onbekende DNA-fragmenten worden opgedeeld waarna deze geamplificeerd worden met primers
waarvan 1 gebiotinyleerd is (B-adapter)
- Adapters
o A: PCR-primer en sequencing primer site + key sequence
o B: PCR-primer en sequencing primer site + key sequence + biotine
- Key sequence = TCAG → nodig voor normalisering van toestel omdat er altijd maar 1 van elk nucleotide
na elkaar komt
- Opzuivering (zie afbeelding hierboven)
o Gebruik van magnetische streptavidine beads waar biotine van DNA op kan binden
o Enkel B-adapters kunnen eraan binden → DNA-fragmenten met A- en B-adapter of twee B-
adapters zullen binden, fragmenten met twee A-adapters zullen niet binden
o Denaturatie: dubbelstrengen worden enkelstrengen en enkel van de strengen met A- en B-
adapter zal 1 streng loskomen omdat enkel één van de twee gebiotinyleerd is
o Resultaat: Juiste enkelstrengen blijven over in oplossing
- Sequencing bead: bevat oligonucleotide complementair met B-adapter waaraan vrije A-B-fragmenten
zullen binden → best 1 fragment per bead voor amplificatie
- Emulsie-PCR: PCR van template gebonden op sequencing beads die worden verdeeld in waterdruppels
in olie → resultaat: beads met veel fragmenten van zelfde stukje DNA
- Emulsie oplossen om alle beads af te zonderen
- Binding van primer met biotine aan DNA-fragmenten (enkelstrengig) op bead om beads met fragmenten
te kunnen afzonderen
- Sequeneren
o Verspreiding van beads over wells in picotiterplaat (één bead per
well) + toevoegen van beads met geïmmobiliseerde enzymen
o Afzonderlijk dNTP’s over plaat laten vloeien zodat die elk apart
kunnen ingebouwd worden op template door polymerase waarbij
pyrofosfaat wordt vrijgegeven
o ATP-sulfurylase: Pyrofosfaat reageert met adenosine 5’-
fosfosulfaat om ATP te vormen
o Luciferase: omzetting van substraat naar oxyluciferine m.b.v. het
ATP uit de vorige reactie waarbij ook licht wordt vrijgegeven dat
kan gedetecteerd worden met CCD (charge-coupled device)
camera → intensiteit van licht per well komt overeen met hoeveel
van bepaald nucleotide werden toegevoegd bij synthese
o Apyrase: breekt ongebruikte nucleotiden en ATP af zodat er geen
interferentie is bij de toediening van het volgende nucleotide
- Nadeel: Niet mogelijk voor lange fragmenten + vaak fouten in meting bij lange herhaling van zelfde
nucleotide in sequentie (homopolymeerprobleem)
Semiconductor sequencing (Ion Torrent)
2
,SV Omica en bio-informatica Dries Vrindts
- Grotendeels gelijkaardig aan Pyrosequensing: A- en P1-adapter
- Detecteren van protonvrijgave bij DNA-synthese met behulp van halfgeleider in chip
- Fragmentatietechniek blijft hetzelfde
- Bij te lage hoeveelheid DNA-fragmenten (na adapterligatie) kan er nog PCR-amplificatie gedaan
worden, maar wel risico op bias → probleem bij metagenoom om bepaald fragment meer aan te maken
terwijl ratio’s tussen fragmenten belangrijk zijn
- Clonal amplificatie op bead: één enkel fragment per bead is ideaal zodat bead enkel kopieën van dit
fragment bevat en zo kan afgezonderd worden en geen fragmenten verloren gaan of beads verkeerde
signalen geven → overmaat aan beads toevoegen
- P1-adapter kan binden op bead/Ion sphere particle (ISP),
wanneer er geen streng gebonden is kan een fluor 488-
gelabelde probe binden op de bead en anders niet
- ISP-aanrijking: Op vrije A-adapter kan fluor 647-gelabelde
probe binden met biotine → afzondering met magnetische
streptavidine beads
- Na aanrijking: sequeneren en protonvrijgave meten op chip
tijdens polymerisatie met afwisselende nucleotiden die
overvloeien → variatie van volgorde van nucleotiden
doorheen de tijd om langere fragmenten te sequeneren
- Probleem van lineariteit en homopolymeren blijft: moeilijk om signalen van key sequence te gebruiken
als maatstaf voor sterkere signaal als signalen niet altijd proportioneel zijn met het aantal nucleotiden
die na elkaar gesequeneerd zijn
- Verschillende chips worden gebruikt voor verschillende toepassingen
- Nadeel: Veel manueel werk en voorzichtigheid nodig bij laden van chip (luchtbellen) en maken van
buffers
o Gebruik van wegwerpcassettes met prefab buffer om het proces te versnellen → enkel voor
onderzoek en niet voor diagnostiek vanwege traceerbaarheid van buffersamenstelling
Sequencing by synthesis (Illumina)
- Stappen
1) Fragmentatie + adapterligatie gelijktijdig op bead
met transposomen: bead bevat transposomen met
adaptersequenties in die op bepaalde afstand van
elkaar liggen afhankelijk van hoe lang fragmenten
moeten zijn → DNA-strengen komen op bead te
liggen en worden gefragmenteerd door het
inbouwen van adaptersequenties → fragmenten
met 1 of 2 adapters ontstaan
2) Amplificatie vóór het plaatsen op flow cell met nieuwe adapters op primers voor binding op flow
cell
3) Flow cell bevat primers gebonden op de bodem waaraan de adapters van de fragmenten
kunnen binden, daarna vindt polymerisatie plaats vanaf gebonden primer
4) Na polymerisatie is er denaturatie en wordt template DNA weggewassen → verspreide
moleculen gebonden aan flow cell
5) Bridge amplificatie: binding van adapter aan uiteinde van DNA-fragment aan lege
complementaire primer in de buurt door het fragment te buigen m.b.v. flow door de flow cell
+ polymerisatie vanaf nieuwe primer (andere primer dan in stap 3 vanwege andere adapter)
6) Opnieuw denaturatie waardoor er nu twee primers gebonden zijn aan een fragment
7) Verschillende keren bridge amplificatie herhalen om clusters met DNA-fragmenten te vormen
8) Cleaving van reverse strengen aan primer om enkel forward strengen te behouden
9) 3’-blocking om ongewilde priming te voorkomen
3
, SV Omica en bio-informatica Dries Vrindts
10) Binden van sequencing primer
11) Sequeneren: gebruik van dNTP’s die elk verschillend gelabeld zijn met fluorescente terminators
→ meten van fluorescent signaal in verschillende clusters + stoppen van polymerisatie bij elke
base totdat terminator wordt afgebroken (oplossing voor homopolymeerprobleem)
- Aandachtspunten
o Clusterdensiteit: Optimale densiteit om genoeg data te kunnen verzamelen en flow cell
efficiënt te gebruiken en niet te veel informatie van clusters te moeten weglaten door overlap →
under- of overclustering voorkomen door goede
opzuivering en concentratiebepaling
o Nucleotidediversiteit: Genoeg variatie in
sequenties van fragmenten nodig zodat clusters
tijdens cluster calling in eerste vier cycli
onderscheiden kunnen worden van elkaar
doordat ze verschillend signaal geven en niet
toevallig zelfde signaal door gelijke
(begin)sequentie → oplossing: Onderclustering
of toevoegen/spike-in van hoogdiverse fragmentbibliotheek (PhiX, altijd minstens 1% toevoegen
maar tot 5% mogelijk en zelfs 50% voor 16S rRNA)
o Niet-synchroon sequeneren: wasstappen en terminatorverwijdering zijn niet altijd 100%
efficiënt en kunnen ervoor zorgen dat bepaalde strengen in een cluster niet meer aan dezelfde
lengte worden gepolymeriseerd → verschillende signalen in één cluster maakt cluster
onbruikbaar
- I.p.v. vier verschillende fluorescente kleuren te gebruiken kunnen er ook twee kleuren gebruikt worden
waarbij C rood, T groen, A rood en groen en G niet gelabeld is zodat de signalen kunnen onderscheiden
worden, detectie met filters voor de twee kleuren
- Bidirectioneel/paired-end sequeneren: zowel reverse als forward streng sequeneren tot 300 bp (vaak bij
fragmenten die langer zijn dan 300 bp waardoor enkel deel van sequentie per keer kan gesequeneerd
worden en daardoor in twee richtingen sequeneren en daarna aligneren) door twee keer clusters te
genereren en te sequeneren met verschillende primers → aligneren van sequenties om originele DNA te
reconstrueren
DNBseq
- Na fragmentatie, adapterligatie en denaturatie kan DNA
gecirculariseerd worden door oligo te gebruiken die
complementair is aan de adapters en ze zal linken aan elkaar →
circulair DNA nodig om rolling circle amplificatie te doen zodat
een DNA nanoball (DNB) ontstaat
- Moeilijkheid om DNB zo groot mogelijk te maken om genoeg
materiaal te hebben voor sequenering zodat het signaal sterk
genoeg is
- Planten van DNB’s in flow cell en sequenering starten met fluorescent gelabelde dNTP’s
Multiplex sequencing
- Verschillende stalen kunnen tegelijk gesequeneerd worden door het gebruik van verschillende tags
(multiplex identifiers = MID) in de sequentiebibliotheken om elk staal te identificeren
- Targeted/amplicon sequencing: gebruik van fusion primers om specifieke regio in het genoom te
amplificeren + MID om elk fragment te identificeren
4
Samenvatting omica en bio-informatica
Omica
Hoofdstuk 1: Next-generation sequensing methodes
- Generaties
o Eerste: Maxam-Gilbert (radioactieve labeling) en Sanger sequencing (ddNTP’s)
o Tweede: Korte DNA-fragmenten, bv. Pyrosequencing, semiconductor sequencing en
sequencing by synthesis
o Derde: Lange DNA-fragmenten → single molecule methodes, bv. Pacific Biosciences en Oxford
Nanopore Technologies
- Input-DNA moet hoog moleculair gewicht zijn, vrij van RNA, hoge zuiverheid en hoge concentratie
- Nanodrop (spectrofotometrie) gebruiken om zuiverheid na te gaan, Fluorometrie om concentratie te
bepalen met behulp van intercallating agent (verschil in fluorescentie tussen gebonden en niet-
gebonden molecule)
Tweede generatie sequencing
- DNA-fragmentatie nodig om bepaalde lengte van DNA-fragmenten te bekomen
o Enzymatische lyse: gebruik van verschillende restrictie-enzymen om fragmenten te creëren,
tijdsduur van werking aanpassen om bepaalde grootte van fragmenten te bekomen
o Covaris: ultrasone golven worden geconcentreerd in bepaalde positie in waterbad waar epje
met DNA kan geplaatst worden voor fragmentatie → kleiner wattage dan bij sonicatie over heel
bad, dus minder opwarming
o Verneveling (nebulisatie): Staal vernevelen in speciaal toestel om kleinere fragmenten te
krijgen
o HydroShear: hydrodynamische krachten gebruiken om DNA-oplossing heen en weer te sturen
doorheen membraan, pompsnelheid optimaliseren per staal(soort) om gewenste lengte te
verkrijgen
- Capilaire elektroforese
o Als kwaliteitscontrole van staal alvorens te sequeneren
o Op microfluidica = chip met verschillende wells voor staal
en gels voor elektroforese → bevat separtion channel waar
ook detectie gebeurt
o Range van detectie tussen 35 en 10380 bp
o Staal bevat veel fragmenten met veel verschillende lengtes
waarbij ook 35 en 10380 bp-fragmenten worden gespiked
om resultaten te ijken na elektroforese
- Fragmentselectie
o E-gel SizeSelect: Gel met twee rijen welletjes waar in één rij stalen en ladder worden geladen
waarna de stalen naar de tweede rij lopen, als ladder met door tweede well is gemigreerd en
juiste range van ladder rond de well ligt (onder kort, boven lang fragment) kan staal uit andere
wells worden gehaald waardoor dit de juiste range van lengte bevat
o Pippin systeem: automatische scheiding op grote van het DNA door staal te laten lopen door
kanaal met detectie van de lengte, bij juiste range van lengte wordt DNA gescheiden in apart
kanaal dat terug zal afgesloten worden als alle fragmenten van juiste lengte zijn afgezonderd
Pyrosequencing (454 sequencing)
1
,SV Omica en bio-informatica Dries Vrindts
- Principe: sequencing by synthesis → sequencing via synthese met PCR met template en primers
waarbij lichtsignaal wordt vrijgegeven
- Roche: verbeterde techniek van low througput naar high throughput (meerdere stalen tegelijk)
- Onbekende DNA-fragmenten worden opgedeeld waarna deze geamplificeerd worden met primers
waarvan 1 gebiotinyleerd is (B-adapter)
- Adapters
o A: PCR-primer en sequencing primer site + key sequence
o B: PCR-primer en sequencing primer site + key sequence + biotine
- Key sequence = TCAG → nodig voor normalisering van toestel omdat er altijd maar 1 van elk nucleotide
na elkaar komt
- Opzuivering (zie afbeelding hierboven)
o Gebruik van magnetische streptavidine beads waar biotine van DNA op kan binden
o Enkel B-adapters kunnen eraan binden → DNA-fragmenten met A- en B-adapter of twee B-
adapters zullen binden, fragmenten met twee A-adapters zullen niet binden
o Denaturatie: dubbelstrengen worden enkelstrengen en enkel van de strengen met A- en B-
adapter zal 1 streng loskomen omdat enkel één van de twee gebiotinyleerd is
o Resultaat: Juiste enkelstrengen blijven over in oplossing
- Sequencing bead: bevat oligonucleotide complementair met B-adapter waaraan vrije A-B-fragmenten
zullen binden → best 1 fragment per bead voor amplificatie
- Emulsie-PCR: PCR van template gebonden op sequencing beads die worden verdeeld in waterdruppels
in olie → resultaat: beads met veel fragmenten van zelfde stukje DNA
- Emulsie oplossen om alle beads af te zonderen
- Binding van primer met biotine aan DNA-fragmenten (enkelstrengig) op bead om beads met fragmenten
te kunnen afzonderen
- Sequeneren
o Verspreiding van beads over wells in picotiterplaat (één bead per
well) + toevoegen van beads met geïmmobiliseerde enzymen
o Afzonderlijk dNTP’s over plaat laten vloeien zodat die elk apart
kunnen ingebouwd worden op template door polymerase waarbij
pyrofosfaat wordt vrijgegeven
o ATP-sulfurylase: Pyrofosfaat reageert met adenosine 5’-
fosfosulfaat om ATP te vormen
o Luciferase: omzetting van substraat naar oxyluciferine m.b.v. het
ATP uit de vorige reactie waarbij ook licht wordt vrijgegeven dat
kan gedetecteerd worden met CCD (charge-coupled device)
camera → intensiteit van licht per well komt overeen met hoeveel
van bepaald nucleotide werden toegevoegd bij synthese
o Apyrase: breekt ongebruikte nucleotiden en ATP af zodat er geen
interferentie is bij de toediening van het volgende nucleotide
- Nadeel: Niet mogelijk voor lange fragmenten + vaak fouten in meting bij lange herhaling van zelfde
nucleotide in sequentie (homopolymeerprobleem)
Semiconductor sequencing (Ion Torrent)
2
,SV Omica en bio-informatica Dries Vrindts
- Grotendeels gelijkaardig aan Pyrosequensing: A- en P1-adapter
- Detecteren van protonvrijgave bij DNA-synthese met behulp van halfgeleider in chip
- Fragmentatietechniek blijft hetzelfde
- Bij te lage hoeveelheid DNA-fragmenten (na adapterligatie) kan er nog PCR-amplificatie gedaan
worden, maar wel risico op bias → probleem bij metagenoom om bepaald fragment meer aan te maken
terwijl ratio’s tussen fragmenten belangrijk zijn
- Clonal amplificatie op bead: één enkel fragment per bead is ideaal zodat bead enkel kopieën van dit
fragment bevat en zo kan afgezonderd worden en geen fragmenten verloren gaan of beads verkeerde
signalen geven → overmaat aan beads toevoegen
- P1-adapter kan binden op bead/Ion sphere particle (ISP),
wanneer er geen streng gebonden is kan een fluor 488-
gelabelde probe binden op de bead en anders niet
- ISP-aanrijking: Op vrije A-adapter kan fluor 647-gelabelde
probe binden met biotine → afzondering met magnetische
streptavidine beads
- Na aanrijking: sequeneren en protonvrijgave meten op chip
tijdens polymerisatie met afwisselende nucleotiden die
overvloeien → variatie van volgorde van nucleotiden
doorheen de tijd om langere fragmenten te sequeneren
- Probleem van lineariteit en homopolymeren blijft: moeilijk om signalen van key sequence te gebruiken
als maatstaf voor sterkere signaal als signalen niet altijd proportioneel zijn met het aantal nucleotiden
die na elkaar gesequeneerd zijn
- Verschillende chips worden gebruikt voor verschillende toepassingen
- Nadeel: Veel manueel werk en voorzichtigheid nodig bij laden van chip (luchtbellen) en maken van
buffers
o Gebruik van wegwerpcassettes met prefab buffer om het proces te versnellen → enkel voor
onderzoek en niet voor diagnostiek vanwege traceerbaarheid van buffersamenstelling
Sequencing by synthesis (Illumina)
- Stappen
1) Fragmentatie + adapterligatie gelijktijdig op bead
met transposomen: bead bevat transposomen met
adaptersequenties in die op bepaalde afstand van
elkaar liggen afhankelijk van hoe lang fragmenten
moeten zijn → DNA-strengen komen op bead te
liggen en worden gefragmenteerd door het
inbouwen van adaptersequenties → fragmenten
met 1 of 2 adapters ontstaan
2) Amplificatie vóór het plaatsen op flow cell met nieuwe adapters op primers voor binding op flow
cell
3) Flow cell bevat primers gebonden op de bodem waaraan de adapters van de fragmenten
kunnen binden, daarna vindt polymerisatie plaats vanaf gebonden primer
4) Na polymerisatie is er denaturatie en wordt template DNA weggewassen → verspreide
moleculen gebonden aan flow cell
5) Bridge amplificatie: binding van adapter aan uiteinde van DNA-fragment aan lege
complementaire primer in de buurt door het fragment te buigen m.b.v. flow door de flow cell
+ polymerisatie vanaf nieuwe primer (andere primer dan in stap 3 vanwege andere adapter)
6) Opnieuw denaturatie waardoor er nu twee primers gebonden zijn aan een fragment
7) Verschillende keren bridge amplificatie herhalen om clusters met DNA-fragmenten te vormen
8) Cleaving van reverse strengen aan primer om enkel forward strengen te behouden
9) 3’-blocking om ongewilde priming te voorkomen
3
, SV Omica en bio-informatica Dries Vrindts
10) Binden van sequencing primer
11) Sequeneren: gebruik van dNTP’s die elk verschillend gelabeld zijn met fluorescente terminators
→ meten van fluorescent signaal in verschillende clusters + stoppen van polymerisatie bij elke
base totdat terminator wordt afgebroken (oplossing voor homopolymeerprobleem)
- Aandachtspunten
o Clusterdensiteit: Optimale densiteit om genoeg data te kunnen verzamelen en flow cell
efficiënt te gebruiken en niet te veel informatie van clusters te moeten weglaten door overlap →
under- of overclustering voorkomen door goede
opzuivering en concentratiebepaling
o Nucleotidediversiteit: Genoeg variatie in
sequenties van fragmenten nodig zodat clusters
tijdens cluster calling in eerste vier cycli
onderscheiden kunnen worden van elkaar
doordat ze verschillend signaal geven en niet
toevallig zelfde signaal door gelijke
(begin)sequentie → oplossing: Onderclustering
of toevoegen/spike-in van hoogdiverse fragmentbibliotheek (PhiX, altijd minstens 1% toevoegen
maar tot 5% mogelijk en zelfs 50% voor 16S rRNA)
o Niet-synchroon sequeneren: wasstappen en terminatorverwijdering zijn niet altijd 100%
efficiënt en kunnen ervoor zorgen dat bepaalde strengen in een cluster niet meer aan dezelfde
lengte worden gepolymeriseerd → verschillende signalen in één cluster maakt cluster
onbruikbaar
- I.p.v. vier verschillende fluorescente kleuren te gebruiken kunnen er ook twee kleuren gebruikt worden
waarbij C rood, T groen, A rood en groen en G niet gelabeld is zodat de signalen kunnen onderscheiden
worden, detectie met filters voor de twee kleuren
- Bidirectioneel/paired-end sequeneren: zowel reverse als forward streng sequeneren tot 300 bp (vaak bij
fragmenten die langer zijn dan 300 bp waardoor enkel deel van sequentie per keer kan gesequeneerd
worden en daardoor in twee richtingen sequeneren en daarna aligneren) door twee keer clusters te
genereren en te sequeneren met verschillende primers → aligneren van sequenties om originele DNA te
reconstrueren
DNBseq
- Na fragmentatie, adapterligatie en denaturatie kan DNA
gecirculariseerd worden door oligo te gebruiken die
complementair is aan de adapters en ze zal linken aan elkaar →
circulair DNA nodig om rolling circle amplificatie te doen zodat
een DNA nanoball (DNB) ontstaat
- Moeilijkheid om DNB zo groot mogelijk te maken om genoeg
materiaal te hebben voor sequenering zodat het signaal sterk
genoeg is
- Planten van DNB’s in flow cell en sequenering starten met fluorescent gelabelde dNTP’s
Multiplex sequencing
- Verschillende stalen kunnen tegelijk gesequeneerd worden door het gebruik van verschillende tags
(multiplex identifiers = MID) in de sequentiebibliotheken om elk staal te identificeren
- Targeted/amplicon sequencing: gebruik van fusion primers om specifieke regio in het genoom te
amplificeren + MID om elk fragment te identificeren
4
