Samenvatting H6: emissie(spectro)fotometrie

H6: emissie(spectro)fotometrie
Moleculaire emissie (fluometrie)

Principe van fluorescentie

 Luminescentie: moleculen absorberen licht van hoge energie (korte
golflengte, hoge frequentie) en zenden licht uit van lagere energie
(langere golflengte) (E = h.v)
 Fluorescentie: emissie gebeurt zeer snel na excitatie (10⁻¹² tot 10⁻⁹ s)
o Fluorescerende stoffen
 Fosforescentie: emissie gebeurt traag (10⁻⁸s tot weken na excitatie)

Meting van het uitgezonden licht:

 Meting van het uitgezonden licht door fluorescerende stoffen kent
vooral de analytische toepasseing
 Meting gebeurt door een (spectro)fluorimeter = emissiemeting
(fluorescentie-intensiteit IF wordt gemeten)
o In gunstige omstandigheden: IF is evenredig met de concentratie
van de stof in oplossing

Elektronische toestanden

 EI₁ = grondtoestand van het molecuul
 EI₂ = hogere elektronische toestand, bereikbaar door absorptie van UV-
of zichtbaar licht
 Elke elektronische toestand bevat meerdere vibratie- en
rotatietoestanden

Excitatie en terugval

 Moleculen absorberen licht (afhankelijk van golflengte) → gaan naar een
hogere energietoestand (exciteren)
 Aangeslagen toestand is instabiel → molecuul keert terug naar
grondtoestand (Er) en geeft energie af (meestal onder de vorm van
warmte)

Bij fluorescerende stoffen

 Deel van de energie gaat verloren als warmte (stralingsloze overgang
binnen dezelfde elektronische toestand EB)
 Daarna volgt fluorescentie: terugval naar grondtoestand met uitzending
van licht

Drie fasen van fluorescentie

 Excitatie door geschikte elektromagnetische straling
 Desactivatie: aangeslagen moleculen hebben een energieverlies door
warmte (botsingen met andere moleculen)
 Emissie: fluorescentielicht bij terugval naar grondtoestand

, Belangrijke relatie

h⋅ c
 → λF> λA
Omdat Eexcitatie > Eemissie, geldt: E = h ⋅ v=
λ
(emissie heeft langere golflengte dan absorptie)

Fluorimetrie

 Absorptiespectrum valt niet samen met het emissiespectrum (van
dezelfde stof)
 Gebruik van monochromatoren/monochromator:
o Primair filter/monochromator: kiest excitatiegolflengte
o Secundair filter/monochromator: selecteert uitgezonden straling
 Vaak: excitatie met UV → emissie in zichtbaar licht

Apparatuur

Meetprincipe

 Fluorescentielicht wordt in alle richtingen uitgezonden → niet alles kan
gemeten worden
 Meting gebeurt meestal onder 90° t.o.v. de invallende lichtbundel (I 0)
om storingen door doorgelaten licht (It) te vermijden
 Fluorescentie-intensiteit (IF) is klein en evenredig met concentratie
alleen bij lage concentraties (10⁻⁹ tot 10⁻⁵ mol/L)

Belangrijke componenten van een fluorimeter

 Lichtbron:
o Hoge intensiteit nodig, want fluorescentie-intensiteit is klein →
vaak kwikdamplamp (UV-lijnen) of xenonlamp (breed spectrum
250–600 nm)
 Golflengteselectie:
o Primair filter/monochromator: kiest excitatiegolflengte
o Secundair filter/monochromator: kiest emissiegolflengte
o Filterfluorimeter: gebruikt filters
o Spectrofluorimeter: gebruikt monochromatoren (meer
nauwkeurig)
 Detector:
o Zeer gevoelig → meestal fotovermenigvuldigingsbuis +
versterking
 Meetopstelling:
o Single-beam of double-beam uitvoering
o Speciale kuvet (niet met matte zijkanten)
o Kalibratie: blanco = 0, referentie = 100, dan ijkreeks en
onbekende stalen

Toepassingen