,
1 Flow Cytometrie en Cel Sortering
Prof. Dr. Dirk Van Bockstaele, Directeur Flow Cytometrie Laboratorium,
Esoterix Clinical Trials Services, A Labcorp Company, Mechelen, België.
In: Celkultuur en Immunochemie
de
2 Bachelor Biomedische Wetenschappen
1 Flow Cytometrie en Cel Sortering........................................................................................ 1
1.1 Het Flow Cytometrisch Analyseprincipe ...............................................................................2
1.1.1 Hydrodynamische focussering............................................................................................................ 2
1.1.2 Lichtbron ............................................................................................................................................ 2
1.1.3 Lichtpuls ............................................................................................................................................. 3
1.1.4 Elastische lichtverstrooiing ................................................................................................................. 3
1.1.5 Fluorescentie....................................................................................................................................... 3
1.1.6 Stoke’s verschuiving........................................................................................................................... 4
1.1.7 Optische bank ..................................................................................................................................... 4
1.1.8 Signaal verwerking en digitalisatie ..................................................................................................... 4
1.1.9 Data presentatie .................................................................................................................................. 5
1.2 Het flow cytometrisch sorteringsprincipe..............................................................................6
1.3 Verdere Informatie en webschakels .......................................................................................7
1.4 Flow Cytometrie: Toepassingen .............................................................................................8
1.4.1 Membraan-Antigenische karakterisatie van cellen en CD nomenclatuur ........................................... 8
1.4.1.1 chromoforen in gebruik voor multi-kleur flow cytometrie ......................................................10
1.4.1.2 fluorescentieoverspraak compensatie .......................................................................................10
1.4.1.2.1 Nieuwe trend: software compensatie. ..................................................................................11
1.4.1.2.2 Nieuwe trend: multi-spectrale flow cytometrie. ..................................................................11
1.4.2 Intracellulaire antigenen. ...................................................................................................................12
1.4.3 Analyse van de celcyclusfasen en DNA-inhoud ................................................................................12
1.4.4 Cellulaire activatie & cel proliferatie.................................................................................................13
1.4.5 Cytotoxiciteitsmetingen .....................................................................................................................15
1.4.6 Oxidatieve (respiratoire) burst van PMN...........................................................................................15
1.4.7 Apoptose ............................................................................................................................................15
1.4.8 Transfectie-Efficiënties .....................................................................................................................16
1.4.9 Nabijheidsmetingen ...........................................................................................................................16
1.4.10 Flow microsfeer immuno assay (FMIA) / cytometric bead array of (CBA) .................................16
1.4.11 (Tumor)antigen specifieke T-cel detectie. ....................................................................................17
1.4.12 Nieuwe DNA-kleurstoffen - moleculaire flow cytometrie...........................................................17
1.5 Figuren ....................................................................................................................................18
1.6 Literatuur / Referenties .........................................................................................................32
1/32
,1.1 Het Flow Cytometrisch Analyseprincipe
De techniek van flow cytometrie werd ontwikkeld in de jaren ‘70 van de vorige eeuw en
is gebaseerd op de detectie van de lichtverstrooiingssignalen die opgewekt worden ingevolge
de snelle passage van afzonderlijke cellen doorheen een lichtbundel die tot microscopisch klei-
ne dimensie is gefocusseerd (typische afmeting: ellipsoid intensiteitsprofiel van 20 op 50 µm).
1.1.1 Hydrodynamische focussering
Bekijk Figuur 1 en Figuur 2. Om, vertrekkende van een celsuspensie, de cellen één na
één doorheen de lichtbundelfocus te sturen baseert men zich op het door Crosland-Taylor in
1953 (Nature artikel) ontwikkeld principe van de hydrodynamische focussering van de celsus-
pensiestroom in een -onder laminaire condities stromende- geleidingsvloeistofstroom.
Ter herinnering: laminaire condities worden bepaald door het Reynolds getal
Re = dρν/η,
waarin d= diameter van de buis, ρ = dichtheid van de vloeistof, ν = gemiddelde snelheid van de
vloeistof en η = viscositeit van de vloeistof. Bij condities die een Reynolds getal opleveren <
2300 is de stroom altijd laminair. Wordt deze waarde overschreden dan kunnen er turbulenties
optreden.
Op die manier worden de cellen op één lijn gelijkgericht in de tot microscopische afme-
tingen versmalde celsuspensie-stroom die aan een snelheid van ~10 m/sec precies gericht wordt
doorheen de lichtbundelfocus.
1.1.2 Lichtbron
Als lichtbron wordt veelal geopteerd voor een laser -in plaats van een klassieke licht-
bron (booglamp, filamentlamp)- omwille van zijn zeer hoge radiantie (lichtenergie / oppervlak-
te/hoek) en omdat deze bundel precies kan gefocusseerd worden. De lichtintensiteit van de
uittredende laserlichtbundel kan ook zeer constant gehouden worden (eventueel m.b.v. een
feed-back mechanisme) wat eveneens een prioritaire vereiste is in flow cytometrie: de verschil-
len in lichtintensiteit van de gecollecteerde lichtpulsen moeten een reflectie zijn van verschillen
tussen de passerende cellen en niet een gevolg zijn van lichtbronfluctuaties. De tot hiertoe cou-
rantst gebruikte laser is de luchtgekoelde Argon-ion gaslaser met een emissiegolflengte van 488
nm (blauw), maar andere lasers winnen steeds meer en meer veld.
De ontwikkeling van kleine "solid state" halfgeleider diodelasers heeft verwachtingen
geschapen voor implementatie van meerdere lasers in een enkel instrument: alhoewel deze dio-
de lasers nu reeds in massaproductie zijn (voor de compact disk spelers, CD-ROM) blijft de
moeilijkheid het bereiken van een –voor cytometrie- bruikbare golflengte (de gangbare halfge-
leider lasers emiteren in het rood en nabije infrarood) en het niet-Gaussisch intensiteitprofiel.
Als men dan toch in het rood wenst te exciteren (bv. voor allophycocyanine conjugaten, zie
verder) dan wordt tegenwoordig weer teruggegrepen naar de He-Ne gaslaser (633 nm emmis-
sie) die een onovertroffen laserbundelkwaliteit vertoont (laag ruisniveau).
2/32
, In research instrumenten met open optische bank worden veelal watergekoelde Argon-
ion lasers gebruikt waarvan de emissiegolflengte door gebruik van een Littrow prisma kan ge-
wijzigd worden (belangrijkste lijnen zijn 488 nm/blauwgroen, 515 nm/groen en –mits verwis-
seling van spiegels- UV 351/363 nm). Als tweede/derde laser wordt veelal geöpteerd voor een
luchtgekoelde He-Ne gaslaser en/of een luchtgekoelde He-Cd gaslaser (emissie bij 325
nm/UV). De verschillende laserlichtstralen worden onder elkaar (spatiaal gesepareerd, µm af-
stand van elkaar) op de versmalde celsuspensiestroom gefocusseerd, zodat dezelfde cel ver-
schillende, in tijd gesepareerde, lichtpulsen zal genereren tijdens zijn passage doorheen de
lichtbundels.
Een nieuwe ontwikkeling, die allicht zal leiden tot het verdwijnen van de Ar-ion lasers
uit de analytische instrumenten is de optisch (= m.b.v. diode laser) gepompte solid state (micro-
chip) laser die een lichtbundelkwaliteit oplevert vergelijkbaar met deze van de gaslasers in
combinatie met de lage energievereisten (efficientie) en kleine afmetingen van de diodelasers.
1.1.3 Lichtpuls
Bekijk Figuur 3. Gezien de korte verblijftijd van elke cel in de lichtbundel is het opge-
wekt lichtsignaal inderdaad een lichtpuls (typische tijd: 5 a 10 µsec). Typisch worden zo tot
circa 3.000 cellen/sec voorbij de lichtbundel gestuurd, resulterend in evenveel lichtpulsen (ten
gevolge van lichtverstrooiing) die worden gecollecteerd over verschillende hoeken (smalle
voorwaartse- en brede zijwaartse hoek) ten opzichte van de invallende lichtbundel. (Engelse
termen: FSC= Forward Scatter, SSC: Side Scatter of RAS= Right Angle Scatter).
Elke lichtpuls bevat informatie over de cel waardoor hij opgewekt werd en kan opge-
splitst worden in een elastische (= met behoud van energie dus λ emissie = λ excitatie) component
(de eigenlijke lichtverstrooiing) en een niet-elastische (λ emissie > λ excitatie) component (fluores-
centie).
1.1.4 Elastische lichtverstrooiing
Bekijk Figuur 4a/b. Elastische lichtverstrooiing treedt op telkens licht op een interfase
(grensvlak) tussen twee milieus invalt (celmembraan = interfase tussen intra- en extracellulair
milieu) en is dus functie van het verschil in brekingsindex tussen de twee milieus. Elastische
lichtverstrooiing is voornamelijk opgebouwd uit Fraunhofer diffractie (= buiging) -althans over
voorwaartse detectiehoeken- en verliest op een logaritmische manier aan belang bij breder wor-
dende detectiehoek, waar dan reflectie- (= lichtweerkaatsing) en refractie- (= lichtbreking) fe-
nomenen kunnen waargenomen worden. In een eerste benadering is de Fraunhofer diffractie
(en dus voorwaartse lichtverstrooiing) een maat voor de grootte van het passerend partikel (Mie
theorie) en is de zijwaartse lichtverstrooiing een maat voor de interne- (granulen, onregelmatige
kern) en externe- (onregelmatig celmembraan) complexiteit van het passerend partikel. Neem
er echter nota van dat deze benadering vervalt van zo gauw men de natuurlijke status van de cel
-en dus het verschil in brekingsindex- wijzigt, door manipulaties zoals fixatie of permeabilisa-
tie!
1.1.5 Fluorescentie
Bekijk Figuur 5 en Figuur 6. Bij niet-elastische lichtverstrooiing is er interactie opge-
treden met/aan bestanddelen van het partikel waardoor energie is geabsorbeerd. Veelal betreft
3/32
, het hier lichtabsorptie ter hoogte van chromofore groepen, waarbij deze terug relaxeren vanuit
hun aangeslagen toestand naar de grondtoestand met uitzenden van licht van een grotere golf-
lengte en dus lagere energie-inhoud (aangezien een gedeelte van de geabsorbeerde lichtenergie
als vibratieenergie is afgevoerd). Naargelang van de multipliciteit van de aangeslagen toestand
(triplet of singulet) spreekt men van fosforescentie of fluorescentie: in hetgeen volgt is enkel
fluorescentie van belang. Belangrijke grootheden in dit verband zijn de molaire extinctiecoëffi-
ciënt ε (absorptie) en de kwantumopbrengst Q (fluorescentie): de fluorescentie-intensiteit is
recht evenredig met het product εQ.
Sommige chromofore groepen kunnen reeds natuurlijk in de cel aanwezig zijn (pyridine
en flavine nucleotiden) en deze veroorzaken dan de (meestal ongewenste) achtergrondfluores-
centie. Meestal echter worden de cellen geïncubeerd met chromofore moleculen die specifiek
en stechiometrisch binden aan een bepaalde cellulaire constituent (men spreekt van “probes”
of “sonden” voor deze constituent), waardoor de resulterende fluorescentie een maat zal zijn
voor het relatief voorkomen van deze cellulaire constituent. Sommige chromofore groepen
binden als dusdanig specifiek aan bepaalde cellulaire constituenten en zijn specifieke probes op
zichzelf (bijvoorbeeld nucleïnezuur bindende kleurstoffen, zie later). Antilichamen (zowel mo-
noklonale als polyklonale) vormen een enorm potentieel aan probes voor een onuitputtelijke
reeks aan antigene cellulaire determinanten: deze eiwitprobes zijn echter niet fluorescent van
nature zodat men chromofore groepen moet inbouwen (conjugatie), wil men ze als fluorescente
immunospecifieke probes kunnen benutten.
1.1.6 Stoke’s verschuiving
Als men tegelijkertijd meerdere cellulaire constituenten wil evalueren dan zal men -
althans voor een één laser instrument- voor elk van deze constituenten een specifieke probe
moeten gebruiken wiens chromofore groepen gekenmerkt worden door een zelfde golflengte-
maximum in hun absorptiespectra (een maximum dat zich uiteraard moet situeren rond de
emissiegolflengte van de gebruikte laser, meestal rond 488 nm) maar door een verschillend
golflengtemaximum in hun fluorescentiespectra. Men spreekt van probes met verschillende
Stoke’s verschuivingen: i.e. verschil tussen fluorescentiemaximum en absorptiemaximum. Zie
ook figuur 15 en paragraaf 1.4.1.1.
1.1.7 Optische bank
De lichtpulsen worden gecapteerd door een geschikte optica (korte focale afstand mi-
croscopische lenzen in de voorwaartse en zijwaartse richting) en opgesplitst in de verschillende
relevante golflengtegebieden (lichtverstrooiing, fluorescentie bij verschillende golflengten) via
een set van geschikte optische (dichroische en band-doorlatende) filters: men spreekt van de
optische bank van de flow cytometer (zie Figuur 7). Aan het einde van deze optische wegen
wordt het licht dan finaal opgevangen door “photomultiplier tubes” (PMT’s) waar -zoals hun
naam aanduidt- de opgevangen fotonen een cascade van elektronen teweegbrengt, resulterend
in een elektrische stroompuls (zie Figuur 8).
1.1.8 Signaal verwerking en digitalisatie
Bekijk Figuur 9 en Figuur 10 . Deze stroompulsen kunnen dan verder elektronisch ver-
werkt worden: d.w.z. weerhouden van de piek-, en/of integraal- en/of breedte, gevolgd door
lineaire of logaritmische versterking, (0-12 V signaal) gevolgd door digitalisatie van deze
waarden m.b.v. een analoog naar digitaal conversie (ADC) in een multikanaals-analyser
(MCA) met een resolutie die, tot enkele jaren geleden, de 10 bit (1024 kanalen) niet oversteeg.
4/32
1 Flow Cytometrie en Cel Sortering
Prof. Dr. Dirk Van Bockstaele, Directeur Flow Cytometrie Laboratorium,
Esoterix Clinical Trials Services, A Labcorp Company, Mechelen, België.
In: Celkultuur en Immunochemie
de
2 Bachelor Biomedische Wetenschappen
1 Flow Cytometrie en Cel Sortering........................................................................................ 1
1.1 Het Flow Cytometrisch Analyseprincipe ...............................................................................2
1.1.1 Hydrodynamische focussering............................................................................................................ 2
1.1.2 Lichtbron ............................................................................................................................................ 2
1.1.3 Lichtpuls ............................................................................................................................................. 3
1.1.4 Elastische lichtverstrooiing ................................................................................................................. 3
1.1.5 Fluorescentie....................................................................................................................................... 3
1.1.6 Stoke’s verschuiving........................................................................................................................... 4
1.1.7 Optische bank ..................................................................................................................................... 4
1.1.8 Signaal verwerking en digitalisatie ..................................................................................................... 4
1.1.9 Data presentatie .................................................................................................................................. 5
1.2 Het flow cytometrisch sorteringsprincipe..............................................................................6
1.3 Verdere Informatie en webschakels .......................................................................................7
1.4 Flow Cytometrie: Toepassingen .............................................................................................8
1.4.1 Membraan-Antigenische karakterisatie van cellen en CD nomenclatuur ........................................... 8
1.4.1.1 chromoforen in gebruik voor multi-kleur flow cytometrie ......................................................10
1.4.1.2 fluorescentieoverspraak compensatie .......................................................................................10
1.4.1.2.1 Nieuwe trend: software compensatie. ..................................................................................11
1.4.1.2.2 Nieuwe trend: multi-spectrale flow cytometrie. ..................................................................11
1.4.2 Intracellulaire antigenen. ...................................................................................................................12
1.4.3 Analyse van de celcyclusfasen en DNA-inhoud ................................................................................12
1.4.4 Cellulaire activatie & cel proliferatie.................................................................................................13
1.4.5 Cytotoxiciteitsmetingen .....................................................................................................................15
1.4.6 Oxidatieve (respiratoire) burst van PMN...........................................................................................15
1.4.7 Apoptose ............................................................................................................................................15
1.4.8 Transfectie-Efficiënties .....................................................................................................................16
1.4.9 Nabijheidsmetingen ...........................................................................................................................16
1.4.10 Flow microsfeer immuno assay (FMIA) / cytometric bead array of (CBA) .................................16
1.4.11 (Tumor)antigen specifieke T-cel detectie. ....................................................................................17
1.4.12 Nieuwe DNA-kleurstoffen - moleculaire flow cytometrie...........................................................17
1.5 Figuren ....................................................................................................................................18
1.6 Literatuur / Referenties .........................................................................................................32
1/32
,1.1 Het Flow Cytometrisch Analyseprincipe
De techniek van flow cytometrie werd ontwikkeld in de jaren ‘70 van de vorige eeuw en
is gebaseerd op de detectie van de lichtverstrooiingssignalen die opgewekt worden ingevolge
de snelle passage van afzonderlijke cellen doorheen een lichtbundel die tot microscopisch klei-
ne dimensie is gefocusseerd (typische afmeting: ellipsoid intensiteitsprofiel van 20 op 50 µm).
1.1.1 Hydrodynamische focussering
Bekijk Figuur 1 en Figuur 2. Om, vertrekkende van een celsuspensie, de cellen één na
één doorheen de lichtbundelfocus te sturen baseert men zich op het door Crosland-Taylor in
1953 (Nature artikel) ontwikkeld principe van de hydrodynamische focussering van de celsus-
pensiestroom in een -onder laminaire condities stromende- geleidingsvloeistofstroom.
Ter herinnering: laminaire condities worden bepaald door het Reynolds getal
Re = dρν/η,
waarin d= diameter van de buis, ρ = dichtheid van de vloeistof, ν = gemiddelde snelheid van de
vloeistof en η = viscositeit van de vloeistof. Bij condities die een Reynolds getal opleveren <
2300 is de stroom altijd laminair. Wordt deze waarde overschreden dan kunnen er turbulenties
optreden.
Op die manier worden de cellen op één lijn gelijkgericht in de tot microscopische afme-
tingen versmalde celsuspensie-stroom die aan een snelheid van ~10 m/sec precies gericht wordt
doorheen de lichtbundelfocus.
1.1.2 Lichtbron
Als lichtbron wordt veelal geopteerd voor een laser -in plaats van een klassieke licht-
bron (booglamp, filamentlamp)- omwille van zijn zeer hoge radiantie (lichtenergie / oppervlak-
te/hoek) en omdat deze bundel precies kan gefocusseerd worden. De lichtintensiteit van de
uittredende laserlichtbundel kan ook zeer constant gehouden worden (eventueel m.b.v. een
feed-back mechanisme) wat eveneens een prioritaire vereiste is in flow cytometrie: de verschil-
len in lichtintensiteit van de gecollecteerde lichtpulsen moeten een reflectie zijn van verschillen
tussen de passerende cellen en niet een gevolg zijn van lichtbronfluctuaties. De tot hiertoe cou-
rantst gebruikte laser is de luchtgekoelde Argon-ion gaslaser met een emissiegolflengte van 488
nm (blauw), maar andere lasers winnen steeds meer en meer veld.
De ontwikkeling van kleine "solid state" halfgeleider diodelasers heeft verwachtingen
geschapen voor implementatie van meerdere lasers in een enkel instrument: alhoewel deze dio-
de lasers nu reeds in massaproductie zijn (voor de compact disk spelers, CD-ROM) blijft de
moeilijkheid het bereiken van een –voor cytometrie- bruikbare golflengte (de gangbare halfge-
leider lasers emiteren in het rood en nabije infrarood) en het niet-Gaussisch intensiteitprofiel.
Als men dan toch in het rood wenst te exciteren (bv. voor allophycocyanine conjugaten, zie
verder) dan wordt tegenwoordig weer teruggegrepen naar de He-Ne gaslaser (633 nm emmis-
sie) die een onovertroffen laserbundelkwaliteit vertoont (laag ruisniveau).
2/32
, In research instrumenten met open optische bank worden veelal watergekoelde Argon-
ion lasers gebruikt waarvan de emissiegolflengte door gebruik van een Littrow prisma kan ge-
wijzigd worden (belangrijkste lijnen zijn 488 nm/blauwgroen, 515 nm/groen en –mits verwis-
seling van spiegels- UV 351/363 nm). Als tweede/derde laser wordt veelal geöpteerd voor een
luchtgekoelde He-Ne gaslaser en/of een luchtgekoelde He-Cd gaslaser (emissie bij 325
nm/UV). De verschillende laserlichtstralen worden onder elkaar (spatiaal gesepareerd, µm af-
stand van elkaar) op de versmalde celsuspensiestroom gefocusseerd, zodat dezelfde cel ver-
schillende, in tijd gesepareerde, lichtpulsen zal genereren tijdens zijn passage doorheen de
lichtbundels.
Een nieuwe ontwikkeling, die allicht zal leiden tot het verdwijnen van de Ar-ion lasers
uit de analytische instrumenten is de optisch (= m.b.v. diode laser) gepompte solid state (micro-
chip) laser die een lichtbundelkwaliteit oplevert vergelijkbaar met deze van de gaslasers in
combinatie met de lage energievereisten (efficientie) en kleine afmetingen van de diodelasers.
1.1.3 Lichtpuls
Bekijk Figuur 3. Gezien de korte verblijftijd van elke cel in de lichtbundel is het opge-
wekt lichtsignaal inderdaad een lichtpuls (typische tijd: 5 a 10 µsec). Typisch worden zo tot
circa 3.000 cellen/sec voorbij de lichtbundel gestuurd, resulterend in evenveel lichtpulsen (ten
gevolge van lichtverstrooiing) die worden gecollecteerd over verschillende hoeken (smalle
voorwaartse- en brede zijwaartse hoek) ten opzichte van de invallende lichtbundel. (Engelse
termen: FSC= Forward Scatter, SSC: Side Scatter of RAS= Right Angle Scatter).
Elke lichtpuls bevat informatie over de cel waardoor hij opgewekt werd en kan opge-
splitst worden in een elastische (= met behoud van energie dus λ emissie = λ excitatie) component
(de eigenlijke lichtverstrooiing) en een niet-elastische (λ emissie > λ excitatie) component (fluores-
centie).
1.1.4 Elastische lichtverstrooiing
Bekijk Figuur 4a/b. Elastische lichtverstrooiing treedt op telkens licht op een interfase
(grensvlak) tussen twee milieus invalt (celmembraan = interfase tussen intra- en extracellulair
milieu) en is dus functie van het verschil in brekingsindex tussen de twee milieus. Elastische
lichtverstrooiing is voornamelijk opgebouwd uit Fraunhofer diffractie (= buiging) -althans over
voorwaartse detectiehoeken- en verliest op een logaritmische manier aan belang bij breder wor-
dende detectiehoek, waar dan reflectie- (= lichtweerkaatsing) en refractie- (= lichtbreking) fe-
nomenen kunnen waargenomen worden. In een eerste benadering is de Fraunhofer diffractie
(en dus voorwaartse lichtverstrooiing) een maat voor de grootte van het passerend partikel (Mie
theorie) en is de zijwaartse lichtverstrooiing een maat voor de interne- (granulen, onregelmatige
kern) en externe- (onregelmatig celmembraan) complexiteit van het passerend partikel. Neem
er echter nota van dat deze benadering vervalt van zo gauw men de natuurlijke status van de cel
-en dus het verschil in brekingsindex- wijzigt, door manipulaties zoals fixatie of permeabilisa-
tie!
1.1.5 Fluorescentie
Bekijk Figuur 5 en Figuur 6. Bij niet-elastische lichtverstrooiing is er interactie opge-
treden met/aan bestanddelen van het partikel waardoor energie is geabsorbeerd. Veelal betreft
3/32
, het hier lichtabsorptie ter hoogte van chromofore groepen, waarbij deze terug relaxeren vanuit
hun aangeslagen toestand naar de grondtoestand met uitzenden van licht van een grotere golf-
lengte en dus lagere energie-inhoud (aangezien een gedeelte van de geabsorbeerde lichtenergie
als vibratieenergie is afgevoerd). Naargelang van de multipliciteit van de aangeslagen toestand
(triplet of singulet) spreekt men van fosforescentie of fluorescentie: in hetgeen volgt is enkel
fluorescentie van belang. Belangrijke grootheden in dit verband zijn de molaire extinctiecoëffi-
ciënt ε (absorptie) en de kwantumopbrengst Q (fluorescentie): de fluorescentie-intensiteit is
recht evenredig met het product εQ.
Sommige chromofore groepen kunnen reeds natuurlijk in de cel aanwezig zijn (pyridine
en flavine nucleotiden) en deze veroorzaken dan de (meestal ongewenste) achtergrondfluores-
centie. Meestal echter worden de cellen geïncubeerd met chromofore moleculen die specifiek
en stechiometrisch binden aan een bepaalde cellulaire constituent (men spreekt van “probes”
of “sonden” voor deze constituent), waardoor de resulterende fluorescentie een maat zal zijn
voor het relatief voorkomen van deze cellulaire constituent. Sommige chromofore groepen
binden als dusdanig specifiek aan bepaalde cellulaire constituenten en zijn specifieke probes op
zichzelf (bijvoorbeeld nucleïnezuur bindende kleurstoffen, zie later). Antilichamen (zowel mo-
noklonale als polyklonale) vormen een enorm potentieel aan probes voor een onuitputtelijke
reeks aan antigene cellulaire determinanten: deze eiwitprobes zijn echter niet fluorescent van
nature zodat men chromofore groepen moet inbouwen (conjugatie), wil men ze als fluorescente
immunospecifieke probes kunnen benutten.
1.1.6 Stoke’s verschuiving
Als men tegelijkertijd meerdere cellulaire constituenten wil evalueren dan zal men -
althans voor een één laser instrument- voor elk van deze constituenten een specifieke probe
moeten gebruiken wiens chromofore groepen gekenmerkt worden door een zelfde golflengte-
maximum in hun absorptiespectra (een maximum dat zich uiteraard moet situeren rond de
emissiegolflengte van de gebruikte laser, meestal rond 488 nm) maar door een verschillend
golflengtemaximum in hun fluorescentiespectra. Men spreekt van probes met verschillende
Stoke’s verschuivingen: i.e. verschil tussen fluorescentiemaximum en absorptiemaximum. Zie
ook figuur 15 en paragraaf 1.4.1.1.
1.1.7 Optische bank
De lichtpulsen worden gecapteerd door een geschikte optica (korte focale afstand mi-
croscopische lenzen in de voorwaartse en zijwaartse richting) en opgesplitst in de verschillende
relevante golflengtegebieden (lichtverstrooiing, fluorescentie bij verschillende golflengten) via
een set van geschikte optische (dichroische en band-doorlatende) filters: men spreekt van de
optische bank van de flow cytometer (zie Figuur 7). Aan het einde van deze optische wegen
wordt het licht dan finaal opgevangen door “photomultiplier tubes” (PMT’s) waar -zoals hun
naam aanduidt- de opgevangen fotonen een cascade van elektronen teweegbrengt, resulterend
in een elektrische stroompuls (zie Figuur 8).
1.1.8 Signaal verwerking en digitalisatie
Bekijk Figuur 9 en Figuur 10 . Deze stroompulsen kunnen dan verder elektronisch ver-
werkt worden: d.w.z. weerhouden van de piek-, en/of integraal- en/of breedte, gevolgd door
lineaire of logaritmische versterking, (0-12 V signaal) gevolgd door digitalisatie van deze
waarden m.b.v. een analoog naar digitaal conversie (ADC) in een multikanaals-analyser
(MCA) met een resolutie die, tot enkele jaren geleden, de 10 bit (1024 kanalen) niet oversteeg.
4/32
