METHODEN 2
2. Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
2.1 ZEER BREED GAMMA AAN VRAAGSTELLINGEN
➔ Biomedische wetenschappen focussen op de mens
➔ Niveaus van biomedisch onderzoek: NIVEAUS COMBINEREN!
Organisme (mens of dier) > weefsel > cel > subcellulair
Fysiologische vraagstelling Fysiologie: hoe werkt ons lichaam, hoe wordt
het geregeld, …?
Pathologische vraagstelling Pathologie: wat loopt er fout, hoe ontstaan
= maatschappelijk heel belangrijk ziektes, … ?
breed gaan zoeken naar een specifiek
Open exploratief onderzoek antwoord zonder een specifieke richting te
kiezen
Hypothese gedreven onderzoek een antwoord vooropstellen (= hypothese) en
deze gaan toetsen
a) Fundamenteel onderzoek: gedetailleerde analyse van de moleculaire bestanddelen en
processen in de cel en in het organisme
b) Translationeel onderzoek: transleert de resultaten van het fundamenteel onderzoek naar
het klinisch onderzoek
c) Klinisch onderzoek: patiëntgericht (optimaliseren van diagnose, verbetering in behandeling,
nieuwe geneesmiddelen)
2.2 VERSCHILLENDE SOORTEN ANALYSES
• In vivo = bepalingen bij levende organismen (bijvoorbeeld: meten van
lichaamstemperatuur, …)
• Ex vivo = metingen op stalen van een organisme (bijvoorbeeld: immuunhistochemie van
een biopt)
• In vitro = metingen in de proefbuis (bijvoorbeeld: celcultuur)
• In silico = analyses op een computer (bijvoorbeeld: studies van interactienetwerken)
2.3 ENKELE DEFINITIES
- Precisie = variabiliteit = maat voor reproduceerbaarheid
- Accuraatheid = verschil tussen gemeten waarde en de “echte” waarde
- Detectielimiet = gevoeligheid = kleinste waarde die kan gemeten worden
- Kwantificatielimiet = kleinste waarde die voldoende nauwkeurig kan gemeten worden
, - Robuustheid = mate waarin de methode een consistent resultaat geeft ondanks kleine
verschillen in experimentele parameters (bijvoorbeeld: pH)
4. Eiwitten
4.1 ISOLEREN VAN EIWITTEN
→ Eiwitten zijn essentieel voor ons lichaam (bijvoorbeeld: enzymes die chemische reacties
katalyseren, de antistoffen van ons immuunsysteem, werking van de spieren, structuur van ons
lichaam, …)
startmateriaal homogenisatie ruw eiwitlysaat
(weefsel, bloed, …) (celmembranen kapot maken) (soep van biomoleculen)
- Detergeren: lossen het lipidenmembraan rond cellen op
- Meerdere keren invriezen/ontdooien: alles wat in de cel zat komt zo naar buiten
- Sonicatie: sturen van ultrasone golven op het startmateriaal
Eiwitten in tact houden door een homogenisatiebuffer:
a) Buffer: om de pH onder controle te houden (bij lage pH positief eiwit, bij hoge pH negatief
eiwit → als dit verandert zou de activiteit ook veranderen)
Bijvoorbeeld: cytoplasmatische eiwitten met pH van 7,5 = Tris buffer
b) Zout: ionensterkte creëren om het eiwit goed oplosbaar te houden (mag niet te hoog zijn,
anders zou het eiwit neerslaan)
Bijvoorbeeld: natriumchloride
c) Protease/peptidase inhibitoren: enzymen die eiwitten kapot knippen (als we die niet
tegenhouden, komen deze vrij in het ruw eiwitlysaat en zouden ze de eiwitten verknippen)
d) Fosfatase inhibitoren: enzymen die fosfaatgroepen van een eiwit verwijderen (soms zijn
deze fosforylaties nodig en mogen ze niet verwijderd worden)
e) Detergent: zorgt dat de celmembranen opgelost blijven/dat de eiwitten goed oplosbaar
blijven
Bijvoorbeeld: NP40, CHAPS, SDS, …
f) Reducerend reagens om disulfide bruggen te breken
Bijvoorbeeld: DTT, dithiothreitol, …
, Protease familie (hebben een bepaalde stof Protease inhibitoren (houden de specifieke
in hun katalytisch centrum) stof in KC tegen)
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), BZA
Serine proteasen (benzamidine), aprotinine
(chymo)tripsine, thrombine, … → Binden aan essentiële serine in het
protease om het zo te inactiveren
EDTA
Metalloproteasen → Bindt bivalente kationen zodat er geen
metaalionen meer beschikbaar zijn voor het
metalloprotease
Cysteïne proteasen/thiol proteasen Leupeptine
Aspartaat proteasen Pepstatine
pepsine, renine, cathepsine, …
→ In homogenisatiebuffer: een aangekocht mengsel/cocktail van verschillende protease
inhibitoren (met/zonder EDTA: soms willen we processen bestuderen die nood hebben aan
functionerende kationen, ze mogen dus niet gecapteerd worden door het EDTA)
Fosfatase familie Fosfatase inhibitor
Serine/threonine fosfatasen Natrium fluoride, natrium pyrofosfaat, …
→ Halen fosfaatgroepen weg op serines en
theonines
Tyrosine fosfatasen Natrium orthovanadaat
→ Halen fosfaatgroepen weg op tyrosines
→ In homogenisatiebuffer: een aangekocht mengsel/cocktail van verschillende fosfatase
inhibitoren (serine, threonine en tyrosine zijn de enige AZ die een fosforylatie kunnen ondergaan)
→ Verder opzuiveren van de eiwitten met chromatografie/elektroforese
4.2 AANMAKEN VAN EIWITTEN
Doel:
- Wetenschappelijk onderzoek
o Functie van eiwit bestuderen
o 3D structuur bepalen (bij bijvoorbeeld een nieuw virus dat je wilt onderzoeken)
o Antistoffen opwekken (in een proefdier als reactie op een virus)
- Farmaceutische industrie
o Eiwitmedicijnen aanmaken (kanker wordt vaker bestreden met medicijnen die
gebaseerd zijn op eiwitten, bijvoorbeeld: herceptin)
o Hormoonmedicijnen aanmaken (mensen met diabetes behandelen met insuline)
o Enzym medicijnen aanmaken (een slecht functionerende pancreas kan geen vetten
verteren, dit kan worden opgelost met het toedienen van lipasen)
o Vaccins (bevatten eiwitcomponenten)
- Waspoederindustrie (bevatten lipasen/proteasen die vetten/eiwitten kunnen afbreken)
- Voedingsindustrie (alles waar fermentatie bij betrokken is, zoals bier)
, 4.2.1 CHEMISCHE SYNTHESE IN VITRO
→ Een chemische reactie die we laten opgaan buiten een levend organisme
beschermingsgroep van de zijketen van het AZ om aspecifieke reacties te voorkomen
= harsparel met een korte peptidelinker + reactieve chemische groep
= we voegen een AZ toe (heeft enkel een vrije
carboxyterminale groep om te reageren met
de reactieve chemische groep)
→ Aminoterminus is afgeschermd met een
beschermingsgroep
→Zijketen van het AZ is ook afgeschermd en
kan dus ook niet reageren
= koppelingsreactie (eerste AZ + harsparel +
peptidelinker)
= eerste AZ in het eiwit dat je wilt aanmaken
1. N-alfa-deprotectie:
beschermingsgroep op de N-terminus
verwijderen
= aminoterminus van het GEKOPPELDE aminozuur is vrij om te reageren met een nieuw
(tweede) AZ
= enkel koppeling met carboxyterminaal uiteinde van het nieuwe AZ is mogelijk
harsparel + Koppelingsreactie 1: N-alfa-deprotectie: Koppelingsreactie 2:
linkerpeptide + AZ 1 (carboxyterminaal bescherming op N- AZ 2
reactieve chemische uiteinde) + linker terminus van AZ 1 (carboxyterminaal
groep peptide wordt verwijderd uiteinde) + AZ 1
(aminoterminaal
uiteinde)
= koppelingsreacties worden herhaal totdat het volledige peptide/eiwit is aangemaakt
➔ Einde:
o laatste N-alfa-deprotectie reactie (verwijderen van beschermgroep op N-terminus)
o eiwit verwijderen van peptide linker
o beschermingsgroepen op de zijketens van de AZ verwijderen
2. Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
2.1 ZEER BREED GAMMA AAN VRAAGSTELLINGEN
➔ Biomedische wetenschappen focussen op de mens
➔ Niveaus van biomedisch onderzoek: NIVEAUS COMBINEREN!
Organisme (mens of dier) > weefsel > cel > subcellulair
Fysiologische vraagstelling Fysiologie: hoe werkt ons lichaam, hoe wordt
het geregeld, …?
Pathologische vraagstelling Pathologie: wat loopt er fout, hoe ontstaan
= maatschappelijk heel belangrijk ziektes, … ?
breed gaan zoeken naar een specifiek
Open exploratief onderzoek antwoord zonder een specifieke richting te
kiezen
Hypothese gedreven onderzoek een antwoord vooropstellen (= hypothese) en
deze gaan toetsen
a) Fundamenteel onderzoek: gedetailleerde analyse van de moleculaire bestanddelen en
processen in de cel en in het organisme
b) Translationeel onderzoek: transleert de resultaten van het fundamenteel onderzoek naar
het klinisch onderzoek
c) Klinisch onderzoek: patiëntgericht (optimaliseren van diagnose, verbetering in behandeling,
nieuwe geneesmiddelen)
2.2 VERSCHILLENDE SOORTEN ANALYSES
• In vivo = bepalingen bij levende organismen (bijvoorbeeld: meten van
lichaamstemperatuur, …)
• Ex vivo = metingen op stalen van een organisme (bijvoorbeeld: immuunhistochemie van
een biopt)
• In vitro = metingen in de proefbuis (bijvoorbeeld: celcultuur)
• In silico = analyses op een computer (bijvoorbeeld: studies van interactienetwerken)
2.3 ENKELE DEFINITIES
- Precisie = variabiliteit = maat voor reproduceerbaarheid
- Accuraatheid = verschil tussen gemeten waarde en de “echte” waarde
- Detectielimiet = gevoeligheid = kleinste waarde die kan gemeten worden
- Kwantificatielimiet = kleinste waarde die voldoende nauwkeurig kan gemeten worden
, - Robuustheid = mate waarin de methode een consistent resultaat geeft ondanks kleine
verschillen in experimentele parameters (bijvoorbeeld: pH)
4. Eiwitten
4.1 ISOLEREN VAN EIWITTEN
→ Eiwitten zijn essentieel voor ons lichaam (bijvoorbeeld: enzymes die chemische reacties
katalyseren, de antistoffen van ons immuunsysteem, werking van de spieren, structuur van ons
lichaam, …)
startmateriaal homogenisatie ruw eiwitlysaat
(weefsel, bloed, …) (celmembranen kapot maken) (soep van biomoleculen)
- Detergeren: lossen het lipidenmembraan rond cellen op
- Meerdere keren invriezen/ontdooien: alles wat in de cel zat komt zo naar buiten
- Sonicatie: sturen van ultrasone golven op het startmateriaal
Eiwitten in tact houden door een homogenisatiebuffer:
a) Buffer: om de pH onder controle te houden (bij lage pH positief eiwit, bij hoge pH negatief
eiwit → als dit verandert zou de activiteit ook veranderen)
Bijvoorbeeld: cytoplasmatische eiwitten met pH van 7,5 = Tris buffer
b) Zout: ionensterkte creëren om het eiwit goed oplosbaar te houden (mag niet te hoog zijn,
anders zou het eiwit neerslaan)
Bijvoorbeeld: natriumchloride
c) Protease/peptidase inhibitoren: enzymen die eiwitten kapot knippen (als we die niet
tegenhouden, komen deze vrij in het ruw eiwitlysaat en zouden ze de eiwitten verknippen)
d) Fosfatase inhibitoren: enzymen die fosfaatgroepen van een eiwit verwijderen (soms zijn
deze fosforylaties nodig en mogen ze niet verwijderd worden)
e) Detergent: zorgt dat de celmembranen opgelost blijven/dat de eiwitten goed oplosbaar
blijven
Bijvoorbeeld: NP40, CHAPS, SDS, …
f) Reducerend reagens om disulfide bruggen te breken
Bijvoorbeeld: DTT, dithiothreitol, …
, Protease familie (hebben een bepaalde stof Protease inhibitoren (houden de specifieke
in hun katalytisch centrum) stof in KC tegen)
PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), BZA
Serine proteasen (benzamidine), aprotinine
(chymo)tripsine, thrombine, … → Binden aan essentiële serine in het
protease om het zo te inactiveren
EDTA
Metalloproteasen → Bindt bivalente kationen zodat er geen
metaalionen meer beschikbaar zijn voor het
metalloprotease
Cysteïne proteasen/thiol proteasen Leupeptine
Aspartaat proteasen Pepstatine
pepsine, renine, cathepsine, …
→ In homogenisatiebuffer: een aangekocht mengsel/cocktail van verschillende protease
inhibitoren (met/zonder EDTA: soms willen we processen bestuderen die nood hebben aan
functionerende kationen, ze mogen dus niet gecapteerd worden door het EDTA)
Fosfatase familie Fosfatase inhibitor
Serine/threonine fosfatasen Natrium fluoride, natrium pyrofosfaat, …
→ Halen fosfaatgroepen weg op serines en
theonines
Tyrosine fosfatasen Natrium orthovanadaat
→ Halen fosfaatgroepen weg op tyrosines
→ In homogenisatiebuffer: een aangekocht mengsel/cocktail van verschillende fosfatase
inhibitoren (serine, threonine en tyrosine zijn de enige AZ die een fosforylatie kunnen ondergaan)
→ Verder opzuiveren van de eiwitten met chromatografie/elektroforese
4.2 AANMAKEN VAN EIWITTEN
Doel:
- Wetenschappelijk onderzoek
o Functie van eiwit bestuderen
o 3D structuur bepalen (bij bijvoorbeeld een nieuw virus dat je wilt onderzoeken)
o Antistoffen opwekken (in een proefdier als reactie op een virus)
- Farmaceutische industrie
o Eiwitmedicijnen aanmaken (kanker wordt vaker bestreden met medicijnen die
gebaseerd zijn op eiwitten, bijvoorbeeld: herceptin)
o Hormoonmedicijnen aanmaken (mensen met diabetes behandelen met insuline)
o Enzym medicijnen aanmaken (een slecht functionerende pancreas kan geen vetten
verteren, dit kan worden opgelost met het toedienen van lipasen)
o Vaccins (bevatten eiwitcomponenten)
- Waspoederindustrie (bevatten lipasen/proteasen die vetten/eiwitten kunnen afbreken)
- Voedingsindustrie (alles waar fermentatie bij betrokken is, zoals bier)
, 4.2.1 CHEMISCHE SYNTHESE IN VITRO
→ Een chemische reactie die we laten opgaan buiten een levend organisme
beschermingsgroep van de zijketen van het AZ om aspecifieke reacties te voorkomen
= harsparel met een korte peptidelinker + reactieve chemische groep
= we voegen een AZ toe (heeft enkel een vrije
carboxyterminale groep om te reageren met
de reactieve chemische groep)
→ Aminoterminus is afgeschermd met een
beschermingsgroep
→Zijketen van het AZ is ook afgeschermd en
kan dus ook niet reageren
= koppelingsreactie (eerste AZ + harsparel +
peptidelinker)
= eerste AZ in het eiwit dat je wilt aanmaken
1. N-alfa-deprotectie:
beschermingsgroep op de N-terminus
verwijderen
= aminoterminus van het GEKOPPELDE aminozuur is vrij om te reageren met een nieuw
(tweede) AZ
= enkel koppeling met carboxyterminaal uiteinde van het nieuwe AZ is mogelijk
harsparel + Koppelingsreactie 1: N-alfa-deprotectie: Koppelingsreactie 2:
linkerpeptide + AZ 1 (carboxyterminaal bescherming op N- AZ 2
reactieve chemische uiteinde) + linker terminus van AZ 1 (carboxyterminaal
groep peptide wordt verwijderd uiteinde) + AZ 1
(aminoterminaal
uiteinde)
= koppelingsreacties worden herhaal totdat het volledige peptide/eiwit is aangemaakt
➔ Einde:
o laatste N-alfa-deprotectie reactie (verwijderen van beschermgroep op N-terminus)
o eiwit verwijderen van peptide linker
o beschermingsgroepen op de zijketens van de AZ verwijderen
