Primair artikel 2, synaptopathy, Ron Habets
Introductie
Gewoon 1e figuur besproken
Figuur 1
A. Structuur Munc18 eiwit met de mutatie
B. Hier zie je het iets beter en de rode puntjes geven de mutatieplek aan (hydrofobe pocket).
Deze ligt dus in domein 2 en niet in het syntaxin bindende domein. Niemand wist het verschil
tussen links en rechts duidelijk te beschrijven.
C. Je ziet in WT dat het eiwit gelijk verdeeld is in het cytosol. Bij II zie je dat de mutant ook door
de hele cel zit, maar veel minder duidelijke en je ziet het maar bij 1 cel (de hoeveelheid eiwit
is dus veel lager). Bij III, in ongeveer 20% van de mutanten, zie ze aggregaten om het golgi
(niet erin).
D. Munc18 WT laat meer fluorescerende cellen zien bij 32 graden dan de mutant.
E. Eiwitexpressie
F. Bij de mutant heb je bij lagere temperatuur een hogere eiwitexpressie. Verder vinden ze bij
controle geen Munc18-1 eiwit, omdat ze Munc18 dubbele KD cellen gebruiken in dit
experiment. Anders verwacht je ook geen effecten te zien van de mutatie, omdat je dan
rescue hebt door endogene expressie. (Ze kijken hier naar bijnier medulla cellen die
hormonen uitscheiden en dus niet naar neuronen.)
G. Ze hebben naar syntaxin gekeken omdat dat een belangrijke bindingspartner is van Munc18.
Ze zijn bij verschillende temperaturen gaan kijken, omdat er natriumkanaal mutanten zijn die ook tot
epilepsie leiden, maar dan enkel bij hoge temperatuur. Zo zijn ze erbij gekomen temperatuur ook bij
dit experiment te veranderen.
Figuur 2
A. Isothermal titration moet je toch wel begrijpen (principals of itc (voluit) @youtube)
B. Assay
C. Muc18 bindt niet met zichzelf en geen verschil in syntaxin binding tussen WT en mutant.
D. –
E. Syntaxin transport naar membraan gekeken en gekeken of WT en mutant de KD kunnen
redden. Ze zijn even goed in redden dus deze functie is niet aangedaan in mutant en niet
afhankelijk van temp. Je ziet duidelijk bij KD geen lokalisatie aan membraan en Munc18 is
daar dus belangrijk voor.
Onderste regel E aangegeven dat de aggregaten geen effect hebben op syntaxin transport,
want desondanks de aggregaten gaat dat nog steeds goed en dit zie je dus in zo’n 20% v/d
cellen.
Figuur 3
Microscopie methode bekijkt alleen het oppervlak
zodat je goed de fusie events kan zien. Met die
eminescent wave.
A. Secretie granulen zie je hier en met wit is
de fusie aangegeven. In het wit is NPY te
zien doordat dat met mCherry gefuseerd
is. Doordat dit in de vesicle zit, zie je
duidelijk blaasjes en zodra het fuseert
verdwijnt het signaal doordat NPY dan
diffundeert.
Introductie
Gewoon 1e figuur besproken
Figuur 1
A. Structuur Munc18 eiwit met de mutatie
B. Hier zie je het iets beter en de rode puntjes geven de mutatieplek aan (hydrofobe pocket).
Deze ligt dus in domein 2 en niet in het syntaxin bindende domein. Niemand wist het verschil
tussen links en rechts duidelijk te beschrijven.
C. Je ziet in WT dat het eiwit gelijk verdeeld is in het cytosol. Bij II zie je dat de mutant ook door
de hele cel zit, maar veel minder duidelijke en je ziet het maar bij 1 cel (de hoeveelheid eiwit
is dus veel lager). Bij III, in ongeveer 20% van de mutanten, zie ze aggregaten om het golgi
(niet erin).
D. Munc18 WT laat meer fluorescerende cellen zien bij 32 graden dan de mutant.
E. Eiwitexpressie
F. Bij de mutant heb je bij lagere temperatuur een hogere eiwitexpressie. Verder vinden ze bij
controle geen Munc18-1 eiwit, omdat ze Munc18 dubbele KD cellen gebruiken in dit
experiment. Anders verwacht je ook geen effecten te zien van de mutatie, omdat je dan
rescue hebt door endogene expressie. (Ze kijken hier naar bijnier medulla cellen die
hormonen uitscheiden en dus niet naar neuronen.)
G. Ze hebben naar syntaxin gekeken omdat dat een belangrijke bindingspartner is van Munc18.
Ze zijn bij verschillende temperaturen gaan kijken, omdat er natriumkanaal mutanten zijn die ook tot
epilepsie leiden, maar dan enkel bij hoge temperatuur. Zo zijn ze erbij gekomen temperatuur ook bij
dit experiment te veranderen.
Figuur 2
A. Isothermal titration moet je toch wel begrijpen (principals of itc (voluit) @youtube)
B. Assay
C. Muc18 bindt niet met zichzelf en geen verschil in syntaxin binding tussen WT en mutant.
D. –
E. Syntaxin transport naar membraan gekeken en gekeken of WT en mutant de KD kunnen
redden. Ze zijn even goed in redden dus deze functie is niet aangedaan in mutant en niet
afhankelijk van temp. Je ziet duidelijk bij KD geen lokalisatie aan membraan en Munc18 is
daar dus belangrijk voor.
Onderste regel E aangegeven dat de aggregaten geen effect hebben op syntaxin transport,
want desondanks de aggregaten gaat dat nog steeds goed en dit zie je dus in zo’n 20% v/d
cellen.
Figuur 3
Microscopie methode bekijkt alleen het oppervlak
zodat je goed de fusie events kan zien. Met die
eminescent wave.
A. Secretie granulen zie je hier en met wit is
de fusie aangegeven. In het wit is NPY te
zien doordat dat met mCherry gefuseerd
is. Doordat dit in de vesicle zit, zie je
duidelijk blaasjes en zodra het fuseert
verdwijnt het signaal doordat NPY dan
diffundeert.
