Naam: Bregje Vanlanduyt Jaar: 2022-2023
Klas: 1BTLA
Elektroforetische scheiding van serumeiwitten volgens het systeem van
HELENA
Doel: In groepjes van 4 of 5 een succesvolle elektroforese volgens het systeem van HELENA
uitvoeren. Hierna een correct besluit vormen over de uitkomsten van de elektroforese.
Principe: Elektroforese is een natuurlijk proces waarbij geladen deeltjes door een
medium bewegen onder invloed van een elektrisch veld. Bij elektroforese wordt
gebruik gemaakt van het feit dat eiwitten in oplossing een bepaalde lading hebben
Dit betekend dat de eiwitten gescheiden worden op basis van hun lading en grootte.
Ook bewegen de geladen deeltjes op een vaste drager (cellulose-acetaat). (Goethals,
Lenvain, & Persijn, 2022)
Daarnaast is het iso-elektrische punt (pI) van een eiwit ook een zeer belangrijk iets bij
elektroforese. Dit punt toont de pH-waarde waarbij het eiwit geen netto elektrische waarde
draagt. De lading van de eiwitten is de resultante van alle geladen aminozuurzijketens die
het eiwit bevat. Het iso-elektrisch punt van gangbare eiwitten ligt tussen pH 1 en 10.
Aminozuren zijn zwakke zuren en kunnen worden omgeladen door een overmaat aan H+
of OH- in het oplosmiddel. Of een eiwit positief dan wel negatief geladen is, hangt dus af
van de pH van de buffer waarin het is opgelost. (Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
pH = pI --> netto lading eiwit neutraal
pH > pI --> netto lading eiwit negatief
pH < pI--> netto lading eiwit positief
Enkele factoren kunnen de snelheid van migratie beïnvloeden: pH van de buffer,
ionensterkte van de buffer, spanning en stroomsterkte en elektro-endosmosis.
1. pH van de buffer
Verschillende eiwitten hebben bij pH 8,8 een verschillende netto-lading en een
verschillende grootte, waardoor de migratie met verschillende snelheden naar de
anode gebeurt.
, (Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
2. Ionensterkte van de buffer
De ionensterkte is de concentratie aan ionen in de oplossing. Hoe hoger de
ionensterkte hoe lager de bewegelijkheid en omgekeerd. Er is dus in invloed op de
snelheid van de verplaatsing. Wanneer de ionsterkte verhoogd zorgt dit voor
weerstand waardoor er ook een opwarming kan ontstaan. Wanneer de ionensterkte
stijgt zorgt dit voor verdamping waardoor er een kans is op denaturatie van de
eiwitten
(Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
3. Spanning en stroomsterkte
Hoe hoger de spanning, hoe hoger de migratiesnelheid en hoe hoger de
temperatuur. Dit kan weer leiden tot denatureren van eiwitten.
(Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
4. Elektro-endosmosis
Cellulose acetaat bezit polaire groepen die negatief opgeladen worden wanneer ze
onderworpen zijn aan een potentiaalverschil. Deze negatief geladen groepen hebben
de neiging om naar de anode te migreren, maar ze hangen vast aan de matrix en
kunnen in feite niet bewegen. Als reactie hierop ontstaat er een bufferstroom in de
tegenovergestelde richting, dus richting de kathode.
(Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
Benodigdheden:
- Droogstoof: Heraeus
- Stroombron: Consort
- Micropipet: gilson L328-068
- Elektroforese kamer: M216-007
- Cellulose-acetaatstrip: HELENA
- Onbekend serum: 1
2
5
8
9 (hierover wordt bespreking gemaakt)
In volgorde op strip
- Reagentia
o HR-buffer: inhoud van één zakje oplossen in 750 ml gedestilleerd water. (pH
= 8,8 ; μ = 0,07)
o Kleurstof: (Ponceau S) los 500mg op in 100 ml 5% trichloorazijnzuur in water
Klas: 1BTLA
Elektroforetische scheiding van serumeiwitten volgens het systeem van
HELENA
Doel: In groepjes van 4 of 5 een succesvolle elektroforese volgens het systeem van HELENA
uitvoeren. Hierna een correct besluit vormen over de uitkomsten van de elektroforese.
Principe: Elektroforese is een natuurlijk proces waarbij geladen deeltjes door een
medium bewegen onder invloed van een elektrisch veld. Bij elektroforese wordt
gebruik gemaakt van het feit dat eiwitten in oplossing een bepaalde lading hebben
Dit betekend dat de eiwitten gescheiden worden op basis van hun lading en grootte.
Ook bewegen de geladen deeltjes op een vaste drager (cellulose-acetaat). (Goethals,
Lenvain, & Persijn, 2022)
Daarnaast is het iso-elektrische punt (pI) van een eiwit ook een zeer belangrijk iets bij
elektroforese. Dit punt toont de pH-waarde waarbij het eiwit geen netto elektrische waarde
draagt. De lading van de eiwitten is de resultante van alle geladen aminozuurzijketens die
het eiwit bevat. Het iso-elektrisch punt van gangbare eiwitten ligt tussen pH 1 en 10.
Aminozuren zijn zwakke zuren en kunnen worden omgeladen door een overmaat aan H+
of OH- in het oplosmiddel. Of een eiwit positief dan wel negatief geladen is, hangt dus af
van de pH van de buffer waarin het is opgelost. (Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
pH = pI --> netto lading eiwit neutraal
pH > pI --> netto lading eiwit negatief
pH < pI--> netto lading eiwit positief
Enkele factoren kunnen de snelheid van migratie beïnvloeden: pH van de buffer,
ionensterkte van de buffer, spanning en stroomsterkte en elektro-endosmosis.
1. pH van de buffer
Verschillende eiwitten hebben bij pH 8,8 een verschillende netto-lading en een
verschillende grootte, waardoor de migratie met verschillende snelheden naar de
anode gebeurt.
, (Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
2. Ionensterkte van de buffer
De ionensterkte is de concentratie aan ionen in de oplossing. Hoe hoger de
ionensterkte hoe lager de bewegelijkheid en omgekeerd. Er is dus in invloed op de
snelheid van de verplaatsing. Wanneer de ionsterkte verhoogd zorgt dit voor
weerstand waardoor er ook een opwarming kan ontstaan. Wanneer de ionensterkte
stijgt zorgt dit voor verdamping waardoor er een kans is op denaturatie van de
eiwitten
(Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
3. Spanning en stroomsterkte
Hoe hoger de spanning, hoe hoger de migratiesnelheid en hoe hoger de
temperatuur. Dit kan weer leiden tot denatureren van eiwitten.
(Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
4. Elektro-endosmosis
Cellulose acetaat bezit polaire groepen die negatief opgeladen worden wanneer ze
onderworpen zijn aan een potentiaalverschil. Deze negatief geladen groepen hebben
de neiging om naar de anode te migreren, maar ze hangen vast aan de matrix en
kunnen in feite niet bewegen. Als reactie hierop ontstaat er een bufferstroom in de
tegenovergestelde richting, dus richting de kathode.
(Goethals, Lenvain, & Persijn, 2022)
Benodigdheden:
- Droogstoof: Heraeus
- Stroombron: Consort
- Micropipet: gilson L328-068
- Elektroforese kamer: M216-007
- Cellulose-acetaatstrip: HELENA
- Onbekend serum: 1
2
5
8
9 (hierover wordt bespreking gemaakt)
In volgorde op strip
- Reagentia
o HR-buffer: inhoud van één zakje oplossen in 750 ml gedestilleerd water. (pH
= 8,8 ; μ = 0,07)
o Kleurstof: (Ponceau S) los 500mg op in 100 ml 5% trichloorazijnzuur in water
