BIOTECHNOLOGIE EN
PROTEÏNEGENEESMIDDELEN
1e Master Farmaceutische Zorg
ACADEMIEJAAR 2025-2026
BRIGJE VANDENBERGHE
,TABLE OF CONTENTS
1. Inleiding .............................................................................................................................................................. 3
2. Eiwitten en de translatie ..................................................................................................................................... 4
2.1 Eiwitsynthese ................................................................................................................................................ 4
Signaalsequentie en PTM (= post translationele modificatie) ........................................................................ 4
PTM ................................................................................................................................................................. 4
Expressie systemen......................................................................................................................................... 6
3. Recombinant DNA .............................................................................................................................................. 7
3.1 Plasmide kloneringsvectoren ........................................................................................................................ 7
3.2 pBR322 vector .............................................................................................................................................. 8
3.3 Transformatie ............................................................................................................................................... 8
3.4 Selectie van de transformantien ......................................................................................................... 9
3.5 pUC19 .................................................................................................................................................. 9
3.6 Faagvectoren ..................................................................................................................................... 10
3.7 Bacteriofaag vectoren ....................................................................................................................... 11
3.8 Cosmide vectoren ....................................................................................................................................... 12
4. Biotechnologische technieken .......................................................................................................................... 12
4.1 Screenen van een bibliotheek – isolatie van een gewenste kloon ............................................................. 12
4.2 Southern en northern blotting ................................................................................................................... 16
5. Geneesmiddelen bereid door middel van recombinant DNA .......................................................................... 19
5.1 Cel-culturen ................................................................................................................................................ 19
5.2 Fermentatie en cel-cultuur ......................................................................................................................... 20
5.2 Insuline ....................................................................................................................................................... 26
Productieproces ............................................................................................................................................ 29
5.3 Menselijk groeihormoon ............................................................................................................................ 30
5.4 Hepatitis B virus vaccin ............................................................................................................................... 31
5.5 Tissue plasminogen activator ..................................................................................................................... 34
6. Monoklonale antilichamen ............................................................................................................................... 37
6.1 Wat zijn antilichamen? ............................................................................................................................... 37
6.2 De structuur van immunoglobuline ............................................................................................................ 38
6.3 Ontwikkeling van de humorale immuniteit ................................................................................................ 39
6.4 Functies van antilichamen .......................................................................................................................... 42
6.5 Monoklonale antilichamen ......................................................................................................................... 46
6.6 Recombinante antilichamen ....................................................................................................................... 53
Chimere antilichamen................................................................................................................................... 54
Humaniseren van een mAB .......................................................................................................................... 54
1
, Gehumaniseerde antilichamen .................................................................................................................... 59
6.7 Gebruik van monoklonale antilichamen ..................................................................................................... 59
Therapeutisch gebruik .................................................................................................................................. 59
6.8 Nanobodies ................................................................................................................................................. 65
Hoofdstuk 7: Pharmaco-genomics-proteomics .................................................................................................... 66
7.1 Farmacogenomics ....................................................................................................................................... 67
7.2 Genetisch polymorfisme ............................................................................................................................. 67
7.3 Geneesmiddel-metaboliserende enzymen ................................................................................................. 68
7.4 CYP2D6-polymorfisme ............................................................................................................................ 68
7.4 Geneesmiddel-target polymorfismen......................................................................................................... 68
De analyse..................................................................................................................................................... 69
7.5 Gen-expressie ............................................................................................................................................. 70
Gen-expressie met “DNA-chip” .................................................................................................................... 70
Expressie-analyse.......................................................................................................................................... 70
2
,BIOTECHNOLOGIE EN
PROTEÏNEGENEESMIDDELEN
Examen 1e zit = schriftelijk (2e zit is mondeling)
1. INLEIDING
Biologische geneesmiddelen:
• “Biologics” of “biopharmaceuticals”
• Bloed- en plasmaproducten: afgeleid van menselijk bloed en plasma
➔ Opgezuiverde producten/eiwitten uit plasma als GM dan op de markt
➔ Eiwitten opzuiveren uit bloed -> meer problemen dan traditionele GMen of wnr je de eiwitten
chemisch zou aanmaken
Bv. infecties mogelijk zoals HIV
Risico bestaat dat producten virale contaminanten bevatten (moeten dus verwijderd w via
opzuiveringsstappen)
• Biotechnologische GM
o Recombinante eiwitten: vb insuline
Via recombinante DNA techniek (levende cellen w gemanipuleerd om ze een gewenst eiwit te
laten produceren)
o Monoclonale Antilichamen (mAbs)
o Fusie-eiwitten
• Vaccins (vallen onder noemer van biologics: bv griep-vaccin is opgekweekt in kippeneieren,
afgezonderd en gedood/verzwakt)
• ATMPs (= soort biologics) Geavanceerde therapie-geneesmiddelen gebaseerd op genen, weefsels of
cellen:
o Cel en gentherapie
o Tissue engineered GM: bv. Organen die in bedrijf geprod w (beenmerg, hart, lever,..)
➔ Levertransplantatie niet meer nodig van donor tot acceptor MAAR startende vanuit stuk
lever van patiënt lever genereren
Gebruik v biologische systemen, levende organismen of derivaten daarvan om verschillende medicijnen te
produceren + vaak manipulatie van DNA, RNA, en eiwitten
➔ mRNA vaccin: aangemaakt met derivaat van levende organismen
➔ DNA w relatief makkelijk en goedkoop aangemaakt in labo (mRNA niet)
3
,2. EIWITTEN EN DE TRANSLATIE
2.1 EIWITSYNTHESE
Eiwitsynthese prokaryoten: zie cursus bachelor
SIGNAALSEQUENTIE EN PTM (= POST TRANSLATIONELE MODIFICATIE)
Figuur: mRNA streng met ribosomen op
➔ Meer naar rechts: polypeptideketen w steeds langer
Blauwgroen = signaalpeptide (staat gecodeerd in DNA)
➔ Zorgt ervoor dat eiwit in wording gedurende synthese contact maakt en bindt op receptor
➔ Ribosoom w tegen ER getrokken en eiwitketen gaat door porie in ER
➔ Signaalpeptidase knipt signaalpeptide af in ER
➔ Enzymen voeren glycosylatie stappen uit op eiwitketen in ER
Glycosylaties = belangrijkste vorm
PTM
➔ Suikerresidu w op eiwit
geplaatst (heeft vaak
biologische relevantie)
➔ Staan niet gecodeerd in
ons DNA
➔ Gaat door in lumen v ER
Common core structuur kan op
verschillende manieren vertakt w
Als eiwit een glycoproteïne is, dan is
dat een verzameling v dat eiwit met
verschillende glycosylatie vormen (=
mengsel)
➔ Glycosylaties kunnen effect hebben op activiteit van eiwit
PTM
• Disulfide binding: niet bij bacteriën
o E.coli enkel in periplasma, kan wel geëngineerd worden
o Bij eukaryoten door oxidatieve enzymatische stappen in ER
• Glycosilatie: niet bij bacteriën
o +-70% vd biotech GM (incl. Monoklonale ALen) = glycoproteïnen
o N-linked in eukaryoten (niet in wt E.coli)
o In ER en Golgi systeem
o O-linked enkel in Golgi systeem
• Fosforylatie: minder belangrijk voor GMen want minder stabiel maar biologisch wel van belang
➔ Bv. Eiwitten w gefosforyleerd bij binding aan receptor en fosforyleren zo andere eiwitten waardoor cel
weet dat er iets op receptor zit
• Sulfatatie: bij dieren en planten (niet bij prokaryoten en gisten) naar GM-productie toe minder v belang
4
,O-linked glycosylatie:
• Serine of threonine
• Suikerresidue op het AZ
• Eenvoudig
N-linked glycosylatie:
• Op asparagines
• Asn-X-Ser/Thr (X = om het even welk AZ)
• Core pentasaccharide
• Ingewikkelder dan O-linked
➔ 3 groepen: high mannose, hybride en complex
➔ Complex: bevat mannose maar zijn vertakt met andere
KH residuen
➔ Hybride: 1 zijtak heeft mannose eindstandig en andere
tak heeft vertakkingen
➔ Pijlen: hebben nog een antenne
(zie common antenna)
• Hoe komen die glycosylaties tot
stand? Trimming and branching
➔ Alles start van bovenste vorm (= originele vorm
= bevat core structuur)
➔ Vertakkingen w geknipt met enzymen (linker
kolom)
➔ Additionele vertakkingen met andere enzymen
(rechter kant v schema)
➔ Vanuit 1 structuur kunnen veel andere vormen
uit ontstaan
Eiwit komt in ER terecht, trimming, branching en oogst
(= mengsel vh eiwit in verschillende glycosylatie vormen)
➔ Moeilijk om die ene vorm vh biotechnologisch GM te
bekomen/op te zuiveren
Gist: ook glycosylatie mogelijk en heeft ook weer core structuur
➔ Vertakkingen zijn enkel high mannose (EN veel meer dan bij
de mens) -> kan probleem zijn
➔ High mannose gist als GM toedienen? Groot risico dat
lichaam het herkend als iets lichaamsvreemd en dat er een
AL-respons op komt
5
,Zoogdieren: anders dan mens maar wel gelijkaardig -> w dus gebruikt voor aanmaak v GMen (en we maken
zelden gebruik van mensencellen)
➔ Zoogdiercellen gebruiken die enzymen hebben die zelfde mutaties hebben met dezelfde glycosylaties
zodat het product zoveel mogelijk lijkt op dat van de mens
Insect: ook core maar amper vertakkingen (niet ideaal)
Planten: glycosylaties zijn anders dan bij de mens
Paars bij mensen <-> ook wit bij zoogdieren
➔ Mens beschikt niet over het enzym (CMAH) om paars om te zetten in wit
➔ Mensen eten zoogdieren: immuunsysteem komt in contact met deze vorm v glycosilatie (beschouwd
deze als lichaamsvreemd en soms immuunreactie ertegen)
EXPRESSIE SYSTEMEN
Bacterien: geen (kan wel geëngeneerd worden)
➔ Glycoproteïne kunnen we niet in bacterien produceren (kunnen geen glycosylatie omdat ze de
enzymen ontbreken hiervoor)
Gisten:
• Hypermannosylatie: antigeen reactie
• Andere serine residues ge-O-glycosyleerd
• Pichia pastoris
Zoogdiercel culturen:
• De meeste zoogdiercellen maken een antigene glycosilatie aan
• Humane, apencellen, CHO en baby hamster kidney (BHK) niet
➔ Voor expressiesystemen kunnen we niet om het even welk zoogdier gebruiken
Vaccin MOET immuunrespons uitlokken (= recombinant eiwit + hypergemannolyseerd antigeen)
Humane cellen: voeren exact op dezelfde manier de glycosylatie uit als in ons lichaam
➔ Wrm gebruiken we niet in humane cellen? Virale contaminatie (na toediening zou patiënt ziek worden)
➔ Niet humane cellen: meeste virussen zijn soort-specifiek dus contaminatie w niet doorgegeven aan
mens
Niet veel soorten zoogdieren gebruikt omwille van verschillende soorten glycosylaties tussen de soorten
➔ Cellen vd zoogdieren = tumorcellen v deze dieren die men ooit uit dit dier heeft gehaald en zijn gaan
opkweken
➔ Ook mutatie van CMAH zodat ze net zoals mens een defect enzym hebben en paars niet kunnen
omzetten in wit
6
, 3. RECOMBINANT DNA
Belangrijkste methode:
• mRNA
➔ Wrm mRNA? DNA (+ intronen is VEEL groter dan RNA) en bacteriën zijn prokaryoten en zouden de
intronen vh DNA er niet kunnen uitsplitsen
• Omzetten tot cDNA (PCR werkt enkel op DNA)
• (Selectie): cDNA codeert voor >1000 eiwitten -> we moeten dus deel isoleren dat enkel codeert voor
insuline (= selectie)
• Kloneren (vd cellen die gen bevatten)
• (Selectie): cellen het eiwit tot expressie laten komen
Kloneringsvectoren:
• Plasmiden = meest gebruikt
• Bacteriofagen
• Cosmiden
• (Virussen): veel gebruikt in onderzoek maar minder bij productie v recombinant eiwit
➔ We willen zo min mogelijk risico op virale contaminatie in GM
3.1 PLASMIDE KLONERINGSVECTOREN
Zelf-replicerende, dubbelstrengige circulaire DNA moleculen die extrachromosomaal voorkomen
F (Fertility) plasmiden: w overgedragen vd ene bacterie naar de andere
R plasmiden: bevatten genen die coderen voor AB resistentie
• Ze hebben alle een origin of replication: afh vd origin of replication kan plasmide in vele of slechts enkele
bacteriele species repliceren (“broad” of “narrow-host-range” plasmiden)
• High-copy number plasmiden: 10 tot 100 kopijen per cel
• Low-copy number plasmiden: 1 tot 4 per cel
• Bacteriën kunnen 8 tot 10 verschillende plasmiden bevatten
Figuur: F-plasmide
Rood = genoom vd bacteriën (= circulair en dubbelstrengig)
F plasmiden = coderen zelf voor eiwitten die zorgen voor vorming v pilus op
bacterie
➔ Pilus trekt naburige bacterie naar bacterie met plasmide toe
➔ Deel vh celmembraan zal fusioneren
➔ Thv fusie relaxosoom eiwit en transferosoom eiwit (F plasmide
codeert ook voor deze eiwitten) -> vormen samen complex
➔ Lineair deel doorgegeven aan nieuwe bacterie
Risico dat genetische info overgegeven w naar verkeerde bacterie
➔ Dus niet veel toegepast want men werkt vaak met plamside met AB
resistentie en we willen dus niet dat dit in de natuur zou terecht
komen (WANT zeer snelle verspreiding)
7
PROTEÏNEGENEESMIDDELEN
1e Master Farmaceutische Zorg
ACADEMIEJAAR 2025-2026
BRIGJE VANDENBERGHE
,TABLE OF CONTENTS
1. Inleiding .............................................................................................................................................................. 3
2. Eiwitten en de translatie ..................................................................................................................................... 4
2.1 Eiwitsynthese ................................................................................................................................................ 4
Signaalsequentie en PTM (= post translationele modificatie) ........................................................................ 4
PTM ................................................................................................................................................................. 4
Expressie systemen......................................................................................................................................... 6
3. Recombinant DNA .............................................................................................................................................. 7
3.1 Plasmide kloneringsvectoren ........................................................................................................................ 7
3.2 pBR322 vector .............................................................................................................................................. 8
3.3 Transformatie ............................................................................................................................................... 8
3.4 Selectie van de transformantien ......................................................................................................... 9
3.5 pUC19 .................................................................................................................................................. 9
3.6 Faagvectoren ..................................................................................................................................... 10
3.7 Bacteriofaag vectoren ....................................................................................................................... 11
3.8 Cosmide vectoren ....................................................................................................................................... 12
4. Biotechnologische technieken .......................................................................................................................... 12
4.1 Screenen van een bibliotheek – isolatie van een gewenste kloon ............................................................. 12
4.2 Southern en northern blotting ................................................................................................................... 16
5. Geneesmiddelen bereid door middel van recombinant DNA .......................................................................... 19
5.1 Cel-culturen ................................................................................................................................................ 19
5.2 Fermentatie en cel-cultuur ......................................................................................................................... 20
5.2 Insuline ....................................................................................................................................................... 26
Productieproces ............................................................................................................................................ 29
5.3 Menselijk groeihormoon ............................................................................................................................ 30
5.4 Hepatitis B virus vaccin ............................................................................................................................... 31
5.5 Tissue plasminogen activator ..................................................................................................................... 34
6. Monoklonale antilichamen ............................................................................................................................... 37
6.1 Wat zijn antilichamen? ............................................................................................................................... 37
6.2 De structuur van immunoglobuline ............................................................................................................ 38
6.3 Ontwikkeling van de humorale immuniteit ................................................................................................ 39
6.4 Functies van antilichamen .......................................................................................................................... 42
6.5 Monoklonale antilichamen ......................................................................................................................... 46
6.6 Recombinante antilichamen ....................................................................................................................... 53
Chimere antilichamen................................................................................................................................... 54
Humaniseren van een mAB .......................................................................................................................... 54
1
, Gehumaniseerde antilichamen .................................................................................................................... 59
6.7 Gebruik van monoklonale antilichamen ..................................................................................................... 59
Therapeutisch gebruik .................................................................................................................................. 59
6.8 Nanobodies ................................................................................................................................................. 65
Hoofdstuk 7: Pharmaco-genomics-proteomics .................................................................................................... 66
7.1 Farmacogenomics ....................................................................................................................................... 67
7.2 Genetisch polymorfisme ............................................................................................................................. 67
7.3 Geneesmiddel-metaboliserende enzymen ................................................................................................. 68
7.4 CYP2D6-polymorfisme ............................................................................................................................ 68
7.4 Geneesmiddel-target polymorfismen......................................................................................................... 68
De analyse..................................................................................................................................................... 69
7.5 Gen-expressie ............................................................................................................................................. 70
Gen-expressie met “DNA-chip” .................................................................................................................... 70
Expressie-analyse.......................................................................................................................................... 70
2
,BIOTECHNOLOGIE EN
PROTEÏNEGENEESMIDDELEN
Examen 1e zit = schriftelijk (2e zit is mondeling)
1. INLEIDING
Biologische geneesmiddelen:
• “Biologics” of “biopharmaceuticals”
• Bloed- en plasmaproducten: afgeleid van menselijk bloed en plasma
➔ Opgezuiverde producten/eiwitten uit plasma als GM dan op de markt
➔ Eiwitten opzuiveren uit bloed -> meer problemen dan traditionele GMen of wnr je de eiwitten
chemisch zou aanmaken
Bv. infecties mogelijk zoals HIV
Risico bestaat dat producten virale contaminanten bevatten (moeten dus verwijderd w via
opzuiveringsstappen)
• Biotechnologische GM
o Recombinante eiwitten: vb insuline
Via recombinante DNA techniek (levende cellen w gemanipuleerd om ze een gewenst eiwit te
laten produceren)
o Monoclonale Antilichamen (mAbs)
o Fusie-eiwitten
• Vaccins (vallen onder noemer van biologics: bv griep-vaccin is opgekweekt in kippeneieren,
afgezonderd en gedood/verzwakt)
• ATMPs (= soort biologics) Geavanceerde therapie-geneesmiddelen gebaseerd op genen, weefsels of
cellen:
o Cel en gentherapie
o Tissue engineered GM: bv. Organen die in bedrijf geprod w (beenmerg, hart, lever,..)
➔ Levertransplantatie niet meer nodig van donor tot acceptor MAAR startende vanuit stuk
lever van patiënt lever genereren
Gebruik v biologische systemen, levende organismen of derivaten daarvan om verschillende medicijnen te
produceren + vaak manipulatie van DNA, RNA, en eiwitten
➔ mRNA vaccin: aangemaakt met derivaat van levende organismen
➔ DNA w relatief makkelijk en goedkoop aangemaakt in labo (mRNA niet)
3
,2. EIWITTEN EN DE TRANSLATIE
2.1 EIWITSYNTHESE
Eiwitsynthese prokaryoten: zie cursus bachelor
SIGNAALSEQUENTIE EN PTM (= POST TRANSLATIONELE MODIFICATIE)
Figuur: mRNA streng met ribosomen op
➔ Meer naar rechts: polypeptideketen w steeds langer
Blauwgroen = signaalpeptide (staat gecodeerd in DNA)
➔ Zorgt ervoor dat eiwit in wording gedurende synthese contact maakt en bindt op receptor
➔ Ribosoom w tegen ER getrokken en eiwitketen gaat door porie in ER
➔ Signaalpeptidase knipt signaalpeptide af in ER
➔ Enzymen voeren glycosylatie stappen uit op eiwitketen in ER
Glycosylaties = belangrijkste vorm
PTM
➔ Suikerresidu w op eiwit
geplaatst (heeft vaak
biologische relevantie)
➔ Staan niet gecodeerd in
ons DNA
➔ Gaat door in lumen v ER
Common core structuur kan op
verschillende manieren vertakt w
Als eiwit een glycoproteïne is, dan is
dat een verzameling v dat eiwit met
verschillende glycosylatie vormen (=
mengsel)
➔ Glycosylaties kunnen effect hebben op activiteit van eiwit
PTM
• Disulfide binding: niet bij bacteriën
o E.coli enkel in periplasma, kan wel geëngineerd worden
o Bij eukaryoten door oxidatieve enzymatische stappen in ER
• Glycosilatie: niet bij bacteriën
o +-70% vd biotech GM (incl. Monoklonale ALen) = glycoproteïnen
o N-linked in eukaryoten (niet in wt E.coli)
o In ER en Golgi systeem
o O-linked enkel in Golgi systeem
• Fosforylatie: minder belangrijk voor GMen want minder stabiel maar biologisch wel van belang
➔ Bv. Eiwitten w gefosforyleerd bij binding aan receptor en fosforyleren zo andere eiwitten waardoor cel
weet dat er iets op receptor zit
• Sulfatatie: bij dieren en planten (niet bij prokaryoten en gisten) naar GM-productie toe minder v belang
4
,O-linked glycosylatie:
• Serine of threonine
• Suikerresidue op het AZ
• Eenvoudig
N-linked glycosylatie:
• Op asparagines
• Asn-X-Ser/Thr (X = om het even welk AZ)
• Core pentasaccharide
• Ingewikkelder dan O-linked
➔ 3 groepen: high mannose, hybride en complex
➔ Complex: bevat mannose maar zijn vertakt met andere
KH residuen
➔ Hybride: 1 zijtak heeft mannose eindstandig en andere
tak heeft vertakkingen
➔ Pijlen: hebben nog een antenne
(zie common antenna)
• Hoe komen die glycosylaties tot
stand? Trimming and branching
➔ Alles start van bovenste vorm (= originele vorm
= bevat core structuur)
➔ Vertakkingen w geknipt met enzymen (linker
kolom)
➔ Additionele vertakkingen met andere enzymen
(rechter kant v schema)
➔ Vanuit 1 structuur kunnen veel andere vormen
uit ontstaan
Eiwit komt in ER terecht, trimming, branching en oogst
(= mengsel vh eiwit in verschillende glycosylatie vormen)
➔ Moeilijk om die ene vorm vh biotechnologisch GM te
bekomen/op te zuiveren
Gist: ook glycosylatie mogelijk en heeft ook weer core structuur
➔ Vertakkingen zijn enkel high mannose (EN veel meer dan bij
de mens) -> kan probleem zijn
➔ High mannose gist als GM toedienen? Groot risico dat
lichaam het herkend als iets lichaamsvreemd en dat er een
AL-respons op komt
5
,Zoogdieren: anders dan mens maar wel gelijkaardig -> w dus gebruikt voor aanmaak v GMen (en we maken
zelden gebruik van mensencellen)
➔ Zoogdiercellen gebruiken die enzymen hebben die zelfde mutaties hebben met dezelfde glycosylaties
zodat het product zoveel mogelijk lijkt op dat van de mens
Insect: ook core maar amper vertakkingen (niet ideaal)
Planten: glycosylaties zijn anders dan bij de mens
Paars bij mensen <-> ook wit bij zoogdieren
➔ Mens beschikt niet over het enzym (CMAH) om paars om te zetten in wit
➔ Mensen eten zoogdieren: immuunsysteem komt in contact met deze vorm v glycosilatie (beschouwd
deze als lichaamsvreemd en soms immuunreactie ertegen)
EXPRESSIE SYSTEMEN
Bacterien: geen (kan wel geëngeneerd worden)
➔ Glycoproteïne kunnen we niet in bacterien produceren (kunnen geen glycosylatie omdat ze de
enzymen ontbreken hiervoor)
Gisten:
• Hypermannosylatie: antigeen reactie
• Andere serine residues ge-O-glycosyleerd
• Pichia pastoris
Zoogdiercel culturen:
• De meeste zoogdiercellen maken een antigene glycosilatie aan
• Humane, apencellen, CHO en baby hamster kidney (BHK) niet
➔ Voor expressiesystemen kunnen we niet om het even welk zoogdier gebruiken
Vaccin MOET immuunrespons uitlokken (= recombinant eiwit + hypergemannolyseerd antigeen)
Humane cellen: voeren exact op dezelfde manier de glycosylatie uit als in ons lichaam
➔ Wrm gebruiken we niet in humane cellen? Virale contaminatie (na toediening zou patiënt ziek worden)
➔ Niet humane cellen: meeste virussen zijn soort-specifiek dus contaminatie w niet doorgegeven aan
mens
Niet veel soorten zoogdieren gebruikt omwille van verschillende soorten glycosylaties tussen de soorten
➔ Cellen vd zoogdieren = tumorcellen v deze dieren die men ooit uit dit dier heeft gehaald en zijn gaan
opkweken
➔ Ook mutatie van CMAH zodat ze net zoals mens een defect enzym hebben en paars niet kunnen
omzetten in wit
6
, 3. RECOMBINANT DNA
Belangrijkste methode:
• mRNA
➔ Wrm mRNA? DNA (+ intronen is VEEL groter dan RNA) en bacteriën zijn prokaryoten en zouden de
intronen vh DNA er niet kunnen uitsplitsen
• Omzetten tot cDNA (PCR werkt enkel op DNA)
• (Selectie): cDNA codeert voor >1000 eiwitten -> we moeten dus deel isoleren dat enkel codeert voor
insuline (= selectie)
• Kloneren (vd cellen die gen bevatten)
• (Selectie): cellen het eiwit tot expressie laten komen
Kloneringsvectoren:
• Plasmiden = meest gebruikt
• Bacteriofagen
• Cosmiden
• (Virussen): veel gebruikt in onderzoek maar minder bij productie v recombinant eiwit
➔ We willen zo min mogelijk risico op virale contaminatie in GM
3.1 PLASMIDE KLONERINGSVECTOREN
Zelf-replicerende, dubbelstrengige circulaire DNA moleculen die extrachromosomaal voorkomen
F (Fertility) plasmiden: w overgedragen vd ene bacterie naar de andere
R plasmiden: bevatten genen die coderen voor AB resistentie
• Ze hebben alle een origin of replication: afh vd origin of replication kan plasmide in vele of slechts enkele
bacteriele species repliceren (“broad” of “narrow-host-range” plasmiden)
• High-copy number plasmiden: 10 tot 100 kopijen per cel
• Low-copy number plasmiden: 1 tot 4 per cel
• Bacteriën kunnen 8 tot 10 verschillende plasmiden bevatten
Figuur: F-plasmide
Rood = genoom vd bacteriën (= circulair en dubbelstrengig)
F plasmiden = coderen zelf voor eiwitten die zorgen voor vorming v pilus op
bacterie
➔ Pilus trekt naburige bacterie naar bacterie met plasmide toe
➔ Deel vh celmembraan zal fusioneren
➔ Thv fusie relaxosoom eiwit en transferosoom eiwit (F plasmide
codeert ook voor deze eiwitten) -> vormen samen complex
➔ Lineair deel doorgegeven aan nieuwe bacterie
Risico dat genetische info overgegeven w naar verkeerde bacterie
➔ Dus niet veel toegepast want men werkt vaak met plamside met AB
resistentie en we willen dus niet dat dit in de natuur zou terecht
komen (WANT zeer snelle verspreiding)
7
