Samenvatting gen- en celtechnologie: recombinante DNA technologie

Inhoud
Inteelt ontwikkelt zuivere lijnen .............................................................................................................. 2
Wat is gentechnologie? ........................................................................................................................... 2
Basismethoden in gen- (en cel-) technologie .......................................................................................... 2
Basismethoden in gentechnologie .......................................................................................................... 3
Isolatie/amplificatie van een gen: PCR ................................................................................................ 3
Componenten .................................................................................................................................. 3
Thermal cycling principle................................................................................................................. 3
Taq polymerase werkt enkel vanaf 3’ uiteinde → forward en reverse primers ............................. 4
Muteren van een gen door PCR: overlap PCR ..................................................................................... 4
Grote deletie mutagenese door overlap PCR .................................................................................. 4
Punt mutagenese door overlap PCR ............................................................................................... 6
Grote insertie mutagenese door overlap PCR ................................................................................. 6
Vier methoden om het gen te ‘cloneren’ (overbrengen naar en vermenigvuldigen in een vector)... 8
1. Klassieke cut and paste ............................................................................................................... 8
2. Gibson assembly cloning .......................................................................................................... 10
3. TOPO cloning ............................................................................................................................. 12
4. Gateway cloning ........................................................................................................................ 13
Soorten vectoren ............................................................................................................................... 19
Wat is een vector? ......................................................................................................................... 19
Plasmiden, BACs en YACs .............................................................................................................. 20
Virale vectoren .............................................................................................................................. 23
Stappen in het synthetiseren van een recombinant eiwit .................................................................... 30




1

,Les 1: Recombinante DNA technologie
Inteelt ontwikkelt zuivere lijnen
• Inteelt is paren tussen nauw verwante individuen → Het resulteert in nakomelingen die
homozygoot zijn voor de meeste eigenschappen
• Om ervoor te zorgen dat rassen een eigenschap consistent vertonen en om eventuele
ongewenste eigenschappen te elimineren
• Kan schadelijke, recessieve eigenschappen blootleggen omdat er een grote kans is dat twee
nauw verwante individuen beide drager zijn van een schadelijk recessief allel voor de
eigenschap




Je weet exact welk gen je muteert/deleteert zonder
Wat is gentechnologie? dat je aan andere genen komt <-> inbred stammen

• Het gericht aanpassen van genetische informatie dmv:
o Klassieke kruisingsschema’s
o Moleculair-biologische technieken
• Gentechnologie is een snellere en betrouwbaardere methode om de frequentie van een
specifiek allel in een populatie te verhogen
o Bij deze methode wordt DNA van het ene organisme ingebracht in een
gastorganisme van dezelfde of een andere soort. In het laatste geval gaat het om
transgene organismen
• Genetische manipulatie wordt ook wel recombinante DNA technologie genoemd
• Recombinant DNA wordt gemaakt door DNA-fragmenten van verschillende bronnen met
elkaar te verbinden of te recombineren

Basismethoden in gen- (en cel-) technologie




2

, Basismethoden in gentechnologie
• Isolatie/amplificatie van een gen door PCR
• Muteren van een gen door PCR
• Vier methoden om het gen te ‘cloneren’ (overbrengen naar en vermenigvuldigen in een
vector)
o Klassieke cut and paste
o TOPO cloning
o Gateway cloning
o Gibson cloning
• Soorten vectoren
o Wat is een vector?
o Plasmiden, BACs en YACs
o Virale vectoren

Isolatie/amplificatie van een gen: PCR

• = polymerase chain reaction
• Ontwikkeld door Kary Mullis
• Methode gebruikt om DNA sequenties te amplificeren
• Kan snel een klein monster DNA in een test tube kloneren
• In < 2u is 1 DNA molecule gekopieerd < 109 keer gekopieerd (30 cycles)

Componenten

• DNA template dat de DNA regio (target) bevat die geamplificeerd moet worden
• 2 DNA oligonucleotides of ‘primers’ met sequenties die complementair zijn aan de target
regio
• dNTPs (deoxynucleotidetrifosfaat)
• buffer dat divalente kationen bevat (Mg2+)
o Mg2+ = cofactor voor polymerase
▪ mag ook niet te veel aanwezig zijn, het interageert nl. met negatieve lading
van DNA
• een hittebestendig DNA polymerase voor selectieve en herhaaldelijke DNA amplificatie (met
of zonder ‘proofreading activiteit’) = Taq polymerase

Thermal cycling principle


1) Denaturatie → 95°C
2) Annealing → hier 55°C
→ varieert want hangt af van
GC inhoud van primers
→hoe lager temp, hoe
makkelijker voor primer om
te binden, maar ook hoe
makkelijker om te binden op
plaatsen waar het niet mag
binden
3) Elongatie → 72°C
→optimaal voor polymerase
3