samenvatting biotechnologie DEELTOETS 1&2!

~DNA structuur & replicatie~
DNA STRUCTUUR
• Nucleotide= fosfaat groep (5’) + deoxyribose suiker (pentose met 5C) + stikstofbase (1’)
- 5’-einde: fosfaatgroep
- 3’-einde: suikergroep, verlenging
• Stikstofbasen:
o Purines (2 ringstructuren): Adenine (A), Guanine (G)
o Pyrimidines: Cytosine (C), Thymine (T), Uracil (U)
→ waterstofbruggen: baseparing C-G & A-T tot complementair dsDNA in helixstructuur (antiparallel)
→ fosfodiester binding: verlenging aan 3’-einde

DNA REPLICATIE
• Semi-conservatief: oude+nieuwe streng dmv. complementaire basenparing
1. DNA helicase: dsDNA naar 2 losse strengen
2. Single stranded binding proteins: voorkomen terugval naar dsDNA
3. Primase: maakt RNA-primer
4. DNA polymerase: bindt aan RNA-primer en bindt nucleotide van 5’->3’
- Leading strand: zonder onderbreking, in zelfde richting als replicatievork
- Lagging strand: Okazaki fragmenten verbonden door DNA ligase

TRANSCRIPTIE
→ Centraal dogma: informatie overdracht van DNA->RNA->eiwit
1. Initiatie: RNA-polymerase aan promoter bij Pribnow box of TATA-box
2. Elongatie: RNA-polymerase maakt RNA van 5’-->3’
3. Terminatie: RNA-polymerase laat los na terminatie sequentie of polyadenylatie sequentie

TRANSLATIE
Ribosomen= ribonucleoproteïne complex (RNA+eiwit)
• Kleine ribosomale subeenheid:
• Grote ribosomale subeenheid:
• Initiatior tRNA: gebonden aan Methionine-aminozuur
- Initiatiefactoren
- Hydrolyse GTP voor energie

1. Initiatie: vorming ribonucleoproteïne complex bij Shine Dalgarno sequentie of 5 ‘cap
2. Elongatie:
- codon herkenning door basenparing anticodon tRNA (A-site)
- peptide binding aminozuur P-site en A-site
- translocatie (lege tRNA via E-site weg, en tRNA met aminozuren van A->P-site)
3. Terminatie: release factor herkent stopcodon (peptide komt vrij, ribosomale subeenheden dissociëren)
- Stopcodon: UAA, UAG, UGA

Codonpreferentie: verschillend codongebruik tussen organisme

,EUKARYOOT: kern en membraan omgeven organellen
→ genetisch materiaal: chromatine= lineaire chromosomen met histonen (compacte structuur en regulatie)
• Diploïd (2n): 2 exemplaren van elk chromosoom (22 paar autosomale, 1 paar geslachtschromosomen)
• Zuster chromatines: na duplicatie verbonden bij centromeer
- P-arm (korte) en Q-arm (lange)

I) REPLICATIE:
- Meerdere origins of replication → meerdere replicatievorken
II) TRANSCRIPTIE: in kern tot monocistronisch mRNA
- Start: TATA-box (TATAAA) en CAAT-box (GGCCAATCT)
- Stop: polyadenylatie sequentie
- Algemene transcriptiefactoren
→ RNA processing: exonen isoleren en voor transport en bescherming mRNA
1. splicing pre-RNA (spliceosoom verwijderd intronen dmv SNURPS=eiwit-RNA complex)
2. 5’capping (gemodificeerde Guanine nucleotide)
3. 3’polyadenylatie (Adenine nucleotiden tot poly-A start)
III) TRANSLATIE: in cytoplasma
- Start: herkenning 5’cap en binding kleine subeenheid ribosoom
o Initiator tRNA bindt bij herkenning startcodon (AUG)
o Grote subeenheid ribosoom bindt tot translatiecomplex

PROKARYOOT: geen kern of membraan omgeven organellen
→ genetisch materiaal: circulair DNA, Haploïd (n), plasmiden (resistentie)

I) REPLICATIE:
- 1 origin of replication (ORI) → 2 replicatievorken naar 2 kanten
II) TRANSCRIPTIE: transcriptie & translatie tegelijkertijd in cytoplasma, geen algemene transcriptiefactoren
- Start: pribnow box (TATAAT)
- Stop: terminatie sequentie
→ Operon structuur: 1 promoter, meerdere genen (polycistronisch)
III) TRANSLATIE:
- Start: herkenning Shine Dalgarno sequentie (GGAGGA)
o binding kleine subeenheid ribosoom & initiator tRNA & grote subeenheid ribosoom

, GENEXPRESSIE REGULATIE
EUKARYOOT
I) CHROMATINE MODIFICATIE= celdifferentiatie
▪ DNA methylatie (-CH3): C5 van cytosine, blokkeert binding transcriptie factoren of rekruteren eiwitten
▪ Histon acetylatie -CH3 CO): DNA minder compact, toegankelijk voor transcriptie
▪ Histon methylatie (-CH3): DNA compacter
II) TRANSCRIPTIE REGULATIE= algemene/specifieke transcriptiefactoren
▪ Negatieve regulatie: repressor eiwitten aan silencers
▪ Positieve regulatie: activator aan enhancer sequenties
[DNA bending proteins vormt transcriptie-initiatie complex voor interacties tussen TF, RNA-polymerase, mediator eiwitten]
III) SPLICING
▪ Alternatieve splicing: van pre-mRNA worden verschillende exonen behouden
IV) RNA INTERFERENTIE= niet coderend miRNA
- Dubbelstrengs RNA geknipt door dicer tot siRNA (small interfering RNA)
- siRNA bindt aan RISC complex (RNAi silencing complex)
- Passenger stand afgebroken
- RISC complex met guide strand bindt complementair mRNA (afgebroken of translatie geblokkeerd)
V) EIWIT REGULATIE= stabiliteit en afbraak
▪ Post-translatie modificatie: fosforylatie (actief) en defosforylatie (niet-actief)

PROKARYOOT
I) TRANSCRIPTIE REGULATIE= operon
▪ Negatieve regulatie: repressor op operator (inducer of co-repressor voor conformatie verandering)
▪ Positieve regulatie: activator op activator-binding site


MUTATIES
→ mutaties= verandering in DNA sequentie (erfelijk of verkregen: geïnduceerd, replicatie fout, spontaan)
• Single nucelotide Polymorphisms (SNPs): puntmutatie, alleen effect op betreffend gen
- Silent, missense, nonsense (stopcodon geïntroduceerd), insertie/deletie (frameshift)

Mismatch repair bij puntmutatie:
endonuclease knipt op 2 plekken en breekt streng af, DNA polymerase herstelt streng volgens template, Ligase
herstelt covalente binding


DUBBELSTRENGSE BREUK
Non-homologous end joining: ligatie van uitende zonder aanwezigheid template
Homologe recombinatie: uitwisseling sequenties tussen 2 (vrijwel) identieke DNA sequenties (=universeel proces)
1. Eiwitten herkennen breuk, ontwinden DNA
2. End processing: afbreken 5’eind streng (enkelstrengs 3’uiteinde over)
3. Strand invasion: enkelstrengs DNA gaat basenparen met complementaire streng van ander homoloog
DNA molecuul (2e exemplaar chromosoom)
4. Holiday junction and branch migration: complementair DNA template voor DNA-polymerase
5. Resolution: geknipt en ligatie op verschillende plekken


EPIGENETISCHE VERANDERINGEN
Veranderingen in het chromatine, maar niet in DNA sequentie (methylatie, acetylatie)
→ Celdifferentiatie, omgevingsfactoren, overerfbaar

, DNA TECHNOLOGIE
• Recombinant DNA technologie: combineren verschillende DNA moleculen
→ knippen (restrictie-enzymen) – DNA plakken in vector (ligase) – vector geïntroduceerd in organisme
(transformatie)
- Construct= insert (geplakte DNA) + vector (plasmide)

Restrictie-enzymen/endonuclease: uit bacteriën, verdediging tegen vreemd DNA
• Genetisch palingdroom: specifieke herkenningssequentie die genkipt wordt (bijv. 5’TTCGAA’3)
• EcoRI methylase: methyleert restrictie site om eigen DNA te beschermen
→ asymmetrisch knippen= sticky ends [uitstekend uiteinde, EcoRI herkenningssequentie]
- zelfde restrictie-enzym en sticky ends dmv. basenparing recombinant DNA
→ symmetrisch knippen= blunt ends [minder efficiënt aan elkaar geplakt, HaeIII herkenningssequentie]

Vectoren:
1. Bacteriofagen: gen in dsDNA/virus genoom introduceren
2. plasmiden: makkelijk te isoleren en te reproduceren, maar kan slechts kleine insert dragen
- ORI: zelfstandige replicatie
- Multiple Cloning Site (MCS): klein stukje DNA met veel unieke herkenningssites restrictie-enzymen
o 2 restrictie-enzymen nodig voor introduceren insert
- Selectie markers: cellen selecteren die plasmide hebben opgenomen
o antibioticum resistentie gen (aanwezigheid plasmide) & LacZ gen (opname insert)
3. cosmiden: plasmide met cos-site (herkennings site op virus DNA voor assemblage virus deeltjes)
- Kan net als virus ingepakt worden in eiwitmantel om cel te infecteren
4. bacterial artificial chromosome (BAC): genetisch gemodificeerde F-plasmiden voor grote inserts, niet voor
eiwitexpressie
5. Yeast artificial chromosome (YAC): genetisch gemodificeerde genomen die in gist repliceren
6. Ti vector: natuurlijke plasmiden die plant infecteert (plant maakt eiwit)

I) Blauw wit screening: LacZ gen codeert voor enzym B-galactosidase (breekt X-gal af tot blauw product)
- plasmide introduceren in E.coli stam die LacZ gen mist, komt achter Lac-promotor (=reguleerbaar)
- multiple cloning site in LacZ gen: wanneer insert gekloneerd, LacZ gen inactief (kleurloos=geslaagd)
- allemaal blauw= LacZ gen actief (knippen niet geslaagd)

DNA ISOLEREN
• Chromosomale bank: chromosomaal DNA isoleren, knippen en ligeren in vector, vector in gastheer
(bevatten willekeurig stuk DNA)
➔ Gen+promotor isoleren of gen identificeren waarvan plaats en expressie onbekend
• cDNA banken (complementary DNA): isoleren mRNA (geen intronen meer), toevoegen primer (aan poly-A
staart), cDNA maken dmv. reverse transcriptase, afbreken RNA streng met RNAse (complementair ssDNA
over), dsDNA maken met DNA-polymerase, aanzetten linkers (bevatten restrictie-enzym herkenningssites),
knippen en plakken in vectoren (sticky ends), vector in gastheer (bevatten willekeurig stuk van gen dat tot
expressie komt)
➔ gen identificeren en tot expressie brengen

probe: enkelstrengs DNA of RNA dat complementair is aan gen van interesse & gelabeld (radioactief, fluorescent)
- gebaseerd op homoloog gen of partiële aminozuur sequentie (reverse translation)
reverse translation: je weet aminozuur sequentie en mogelijke mRNA sequentie (meerdere codons voor aminozuur)
colony blotting: selecteren van kolonies met juiste DNA fragmenten met behulp van probe
- bacterie laten groeien tot kolonie op voedingsbodem, kolonie kopiëren naar membraan, cellen laten lyseren
en DNA denatureren, probe toevoegen tegen DNA fragment van interesse (complementaire baseparing),
probe weg wassen (blijft alleen bij ingebouwde), probe zichtbaar maken om hybridisatie zichtbaar te maken,
kolonies uit originele plaat selecteren en uitgroeien