Forensische genetica
1. Mitochondriale DNA analyses
Sequentieprimers zijn NOOIT hetzelfde als amplificatieprimers.
1.1 Probleem van sequentie analyse van poly-C
Als er een tymidine aanwezig is
wordt de poly-C verbroken.
Als er tymidine gemuteerd is naar
een cytosine krijg je wel en
langere poly-C stretch.
Sequentie is niet meer af
te lezen (= fout die
ingebouwd wordt door het
polymerase van de
amplificatie).
Oorzaak: DNA-polymerase heeft problemen om het juiste aantal nucleotiden in te bouwen resulteert in inserties
of deleties van cytosines.
Cytosine-nucleotiden in zowel de HV1- als de HV2-regio’s. Deze regio’s worden vaak aangeduid als de
‘C-reeksen’.
Gevolg: PCR-producten bestaan uit een mengsel van sequenties met verschillende lengtes aan poly-nucleotiden
(e.g. C7, C8, C9) = ‘lengte heteroplasmie’.
Oplossing: Gebruik maken van verschillende
sequentieprimers. Zowel forward als reverse streng
wordt gesequenced (moeten dezelfde resultaten
geven = controle van de sequentie).
In het geval van de poly-C stretch:
sequentieprimer gebruiken die midden in de C-stretch ligt zodat we links en rechts van de poly-C stretch
de sequentie kunnen bepalen.
Of de sequentie 2x opnemen: bevestiging van de genetische variantie die we links en rechts van de poly-
C stretch zien.
, 1.2 Alternatieve analyse voor mtDNA: array
Vraagt veel tijd en inspanning. Probleem
wanneer we veel DNA-stalen hebben.
Op een andere manier: test (mtDNA-array)
om te screenen naar de mtDNA sequenties
die hetzelfde zijn of verschillend zijn van
elkaar (verschillend: Sanger-sequentie).
Manier om mtDNA ta gaan groeperen
wanneer we veel analyses uitvoeren.
Gekend persoon komt niet in aanmerking
met het sporenstaal: geeft een verschillend
patroon weer.
1.2.1 ASO: klassieke methode
Genetische variaties (puntmutaties) o.b.v.
hybridisatie.
PCR-product op een membraan
aanbrengen en membraan hybridiseren
met een oligonucleotide die de variant
bevat (genotype individu nagaan).
Een die het wildtype hybridiseert, het
andere de mutatie.
In dit geval: positief resultaat bij het wildtype en
negatief resultaat bij de mutanten → 2 allelen
aanwezig op het wild-type (middelste
heterozygoot: derde bevat 2x een mutatie).
1.2.2: Reversed-blot methode: Lineaire array typing
Oligoproducten op het membraan
aanbrengen.
Amplificatie waarbij een van de twee
primer gelabeld is met biotine.
Denatureren het PCR-product en
hybridiseren met oligonucleotiden die
aanwezig zijn op de strip.
Amplificatieproduct hybridiseert met
de probe wanneer er 100% match is
(anders krijg je geen streepje).
Welke genetische variaties in het staal
aanwezig zijn: streepjes aflezen van de
aanwezige oligonucleotiden.
, Typering van mtDNA. Elk streepje op het
blot betekent een bepaalde oligo met een
bepaalde genetische variant. Aflezen van
de positieve resultaten = resultaat om te
gaan vergelijken met het spoor en
referentiestaal.
Nadeel: een bepaalde regio met 3
bepaalde genetische varianten geeft geen
resultaat (in het DNA-staal dat we
hybridiseren is er nog een vierde
genetische variant aanwezig die belet dat
een van de drie oligo’s gaat hybridiseren
met het PCR-product). We krijgen dus
geen resultaat (we kunnen enkel zeggen
welke er niet aanwezig is).
Resultaat is zwak (te weinig PCR-product gehybridiseerd: vaak door de aanwezigheid van een extra
genetische variant). We kunnen niet met zekerheid zeggen dat dit de genetische variant is die aanwezig
is in het staal
2 hypothetische resultaten voor niet-overeenkomende K- en Q-monsters. Het K-monster rapporteert een type
van 1-1-1-1-1-1-1-1-1-1, wat overeenkomt met de Cambridge-referentievolgorde. Het Q-monster heeft een
ander patroon en kan daarom worden uitgesloten als zijnde hetzelfde als het K-monster. Opmerkelijk is dat
probe IE binnen HVI1-geen signaal opleverde van een van de drie mogelijke probes. Dit resultaat wordt een
“blank” genoemd en treedt op vanwege aanvullende polymorfismen in de nabijheid van de polymorfe locaties
die voor detectie in de assay zijn ontworpen.
Deze extra polymorfismen verstoren de hybridisatie van het PCR-product, waardoor er geen signaal wordt
waargenomen.
SSO probes: slechts 9 posities
HV1: 16093, 16126, 16129, 16270, 16278, 16304, 16309, 16311, 16362
HV2: 73, 146, 150, 152, 189, 195, 198, 200, 247
1.3 Stappen in mtDNA analyse: interpretatie
1.3.1 Humaan mtDNA referentie sequentie
Sequentie bepaald in 1981 aan de Universiteit van Cambridge
Gekend als de “Anderson” sequentie of “Cambridge Reference Sequence” (CRS)
Universele referentie sequentie voor vergelijking met sequentie data bekomen in een forensisch labo
nomenclatuur: 73G of A73G.
Her-analyse van het originele DNA (individu van Europese afkomst) in 1999
Sequentie gekend als “Revised CRS” of rCRS
Deze vergelijkingen in de verschillande labo’s door gebruik te maken van de Anderson of Cambridge reference
sequentie.
1. Mitochondriale DNA analyses
Sequentieprimers zijn NOOIT hetzelfde als amplificatieprimers.
1.1 Probleem van sequentie analyse van poly-C
Als er een tymidine aanwezig is
wordt de poly-C verbroken.
Als er tymidine gemuteerd is naar
een cytosine krijg je wel en
langere poly-C stretch.
Sequentie is niet meer af
te lezen (= fout die
ingebouwd wordt door het
polymerase van de
amplificatie).
Oorzaak: DNA-polymerase heeft problemen om het juiste aantal nucleotiden in te bouwen resulteert in inserties
of deleties van cytosines.
Cytosine-nucleotiden in zowel de HV1- als de HV2-regio’s. Deze regio’s worden vaak aangeduid als de
‘C-reeksen’.
Gevolg: PCR-producten bestaan uit een mengsel van sequenties met verschillende lengtes aan poly-nucleotiden
(e.g. C7, C8, C9) = ‘lengte heteroplasmie’.
Oplossing: Gebruik maken van verschillende
sequentieprimers. Zowel forward als reverse streng
wordt gesequenced (moeten dezelfde resultaten
geven = controle van de sequentie).
In het geval van de poly-C stretch:
sequentieprimer gebruiken die midden in de C-stretch ligt zodat we links en rechts van de poly-C stretch
de sequentie kunnen bepalen.
Of de sequentie 2x opnemen: bevestiging van de genetische variantie die we links en rechts van de poly-
C stretch zien.
, 1.2 Alternatieve analyse voor mtDNA: array
Vraagt veel tijd en inspanning. Probleem
wanneer we veel DNA-stalen hebben.
Op een andere manier: test (mtDNA-array)
om te screenen naar de mtDNA sequenties
die hetzelfde zijn of verschillend zijn van
elkaar (verschillend: Sanger-sequentie).
Manier om mtDNA ta gaan groeperen
wanneer we veel analyses uitvoeren.
Gekend persoon komt niet in aanmerking
met het sporenstaal: geeft een verschillend
patroon weer.
1.2.1 ASO: klassieke methode
Genetische variaties (puntmutaties) o.b.v.
hybridisatie.
PCR-product op een membraan
aanbrengen en membraan hybridiseren
met een oligonucleotide die de variant
bevat (genotype individu nagaan).
Een die het wildtype hybridiseert, het
andere de mutatie.
In dit geval: positief resultaat bij het wildtype en
negatief resultaat bij de mutanten → 2 allelen
aanwezig op het wild-type (middelste
heterozygoot: derde bevat 2x een mutatie).
1.2.2: Reversed-blot methode: Lineaire array typing
Oligoproducten op het membraan
aanbrengen.
Amplificatie waarbij een van de twee
primer gelabeld is met biotine.
Denatureren het PCR-product en
hybridiseren met oligonucleotiden die
aanwezig zijn op de strip.
Amplificatieproduct hybridiseert met
de probe wanneer er 100% match is
(anders krijg je geen streepje).
Welke genetische variaties in het staal
aanwezig zijn: streepjes aflezen van de
aanwezige oligonucleotiden.
, Typering van mtDNA. Elk streepje op het
blot betekent een bepaalde oligo met een
bepaalde genetische variant. Aflezen van
de positieve resultaten = resultaat om te
gaan vergelijken met het spoor en
referentiestaal.
Nadeel: een bepaalde regio met 3
bepaalde genetische varianten geeft geen
resultaat (in het DNA-staal dat we
hybridiseren is er nog een vierde
genetische variant aanwezig die belet dat
een van de drie oligo’s gaat hybridiseren
met het PCR-product). We krijgen dus
geen resultaat (we kunnen enkel zeggen
welke er niet aanwezig is).
Resultaat is zwak (te weinig PCR-product gehybridiseerd: vaak door de aanwezigheid van een extra
genetische variant). We kunnen niet met zekerheid zeggen dat dit de genetische variant is die aanwezig
is in het staal
2 hypothetische resultaten voor niet-overeenkomende K- en Q-monsters. Het K-monster rapporteert een type
van 1-1-1-1-1-1-1-1-1-1, wat overeenkomt met de Cambridge-referentievolgorde. Het Q-monster heeft een
ander patroon en kan daarom worden uitgesloten als zijnde hetzelfde als het K-monster. Opmerkelijk is dat
probe IE binnen HVI1-geen signaal opleverde van een van de drie mogelijke probes. Dit resultaat wordt een
“blank” genoemd en treedt op vanwege aanvullende polymorfismen in de nabijheid van de polymorfe locaties
die voor detectie in de assay zijn ontworpen.
Deze extra polymorfismen verstoren de hybridisatie van het PCR-product, waardoor er geen signaal wordt
waargenomen.
SSO probes: slechts 9 posities
HV1: 16093, 16126, 16129, 16270, 16278, 16304, 16309, 16311, 16362
HV2: 73, 146, 150, 152, 189, 195, 198, 200, 247
1.3 Stappen in mtDNA analyse: interpretatie
1.3.1 Humaan mtDNA referentie sequentie
Sequentie bepaald in 1981 aan de Universiteit van Cambridge
Gekend als de “Anderson” sequentie of “Cambridge Reference Sequence” (CRS)
Universele referentie sequentie voor vergelijking met sequentie data bekomen in een forensisch labo
nomenclatuur: 73G of A73G.
Her-analyse van het originele DNA (individu van Europese afkomst) in 1999
Sequentie gekend als “Revised CRS” of rCRS
Deze vergelijkingen in de verschillande labo’s door gebruik te maken van de Anderson of Cambridge reference
sequentie.
