Bacterias que no toman la coloración de Gram – PARTE I
Mycobacterium
Un significativo número de las especies del género Mycobacterium son prominentes patógenos,
como los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium leprae. Además,
numerosas especies de micobacterias del ambiente llamadas Mycobacterium no tuberculosos
(MNT) (antes llamadas “micobacterias atípicas”) son responsables por diversos tipos de
enfermedades, especialmente en pacientes con infección por VIH-SIDA. Las micobacterias son
objeto de estudio debido a su importantísima incidencia sobre la Salud Pública. Se conocen más
de 70 especies de Mycobacterium, entre las que aparecen algunas especies de gran importancia
médica como los agentes etiológicos de la tuberculosis humana y la lepra.
Características de las micobacterias
Morfología y tinción. Se trata de bacilos delgados, rectos o ligeramente curvos, inmóviles, que
no presentan cápsula ni forman esporas. Aunque tienen la estructura de un Gram (+), las
micobacterias casi no toman los colorantes de Gram a temperatura ambiente. Sin embargo,
pueden teñirse con fucsina
fenicada alcalina en caliente
(coloración de Ziehl-Neelsen) y
resisten la decoloración con
ácido en medio alcohólico. Esta
particularidad las define como
ácido-alcohol resistentes. La
resistencia a la decoloración se
debe al elevado contenido
lipídico de su pared celular y
sólo se pone de manifiesto si
las envolturas bacterianas
permanecen intactas.
Estructura. La envoltura de las
micobacterias consiste en una
membrana citoplasmática y
una pared celular. Esta última
presenta una gran diferencia
con la de los Gram (+), que
radica en su elevado contenido
de lípidos (60% del peso seco).
La pared de las micobacterias
contiene un grupo heterogéneo
de peptidolípidos, glicolípidos
fenólicos y sulfolípidos (sulfáti-
dos), de acción significativa y
específica en la patogénesis
(Figura 1).
Figura 1. Esquema de las envolturas de M. tuberculosis
Mycobacterium-1
,Metabolismo y cultivo. Los requerimientos nutricionales varían mucho de especie a especie de
micobacteria. Como ejemplos extremos, algunas micobacterias no patógenas del ambiente
pueden desarrollar en los picos de las canillas de agua y en lavatorios. Por el contrario, existen
otras como M. leprae, que jamás pudo ser cultivada en medios artificiales. Las micobacterias son
aerobias estrictas a punto tal que una leve disminución de la concentración de O2 produce un
marcado descenso del ritmo de crecimiento. M. tuberculosis desarrolla mejor en atmósfera de aire
con 10% de CO2. Las micobacterias crecen en medios sintéticos simples, pero para aislarlas de
algunos materiales clínicos se requieren medios selectivos sólidos especialmente adaptados, que
contienen no sólo los nutrientes, sino además inhibidores como el verde de malaquita y
antibióticos, para evitar el crecimiento de la microbiota acompañante, que crece mucho más
velozmente que las micobacterias.
Las micobacterias desarrollan muy lentamente y se requieren como mínimo de 10 a 20 días de
cultivo a 37oC para que las colonias comiencen a hacerse visibles. Compárese su tiempo medio
de generación de 15 a 20 horas, con el de la mayoría de las bacterias, que es de 30 o 40 minutos.
Algunas pocas especies, como M. fortuitum, desarrollan más rápidamente (3 a 7 días para que
una colonia se haga visible). Las micobacterias patógenas prácticamente no desarrollan a
temperatura ambiente. En los cultivos de algunas micobacterias, como las del complejo M. avium-
intracellulare, pueden observarse colonias rugosas (R, cepas virulentas) y lisas (S, avirulentas).
M. tuberculosis forma colonias elevadas, verrugosas y adherentes, de color blanquecino o
amarillento, difíciles de emulsificar debido a su alto contenido en lípidos. En ciertos medios de
cultivo las cepas virulentas se agrupan en manojos paralelos formando largos cordones
enroscados. Estos cordones también pueden ser observados en medios líquidos o en
suspensiones preparadas en agua a partir de una colonia. Esta agrupación característica se debe
a la presencia del factor cuerda.
El cultivo en medios semisólidos va cayendo en desuso en los laboratorios de Bacteriología. La
mayoría de los laboratorios hospitalarios que realizan cultivos utilizan en la actualidad sistemas
automatizados de monitoreo continuo. Mediante estos sistemas, las muestras se cultivan en
medio líquido y puede detectarse la presencia de las micobacterias tuberculosas tras apenas 5 a
14 días de cultivo, dependiendo la densidad bacteriana en la muestra inicial. El agregado de un
inhibidor del crecimiento del complejo M. tuberculosis (que incluye además de esta especie a M.
bovis y M. africanum) a un frasco de cultivo paralelo, permite una identificación preliminar rápida.
Los distintos sistemas disponibles se diferencian en el método de detección del crecimiento de las
micobacterias. El sistema BACTEC 460TB utiliza en el medio de cultivo ácido palmítico marcado
con 14C y el instrumento detecta la producción de CO2 radiactivo. Otros sistemas no utilizan
radiactivos sino la detección de fluorescencia, como el BACTEC 9000MB o BACTEC MGIT 960
(Becton Dickinson) y el MB /BacT ALERT 3D (Biomerieux). Cualquiera de estos sistemas
requiere la decontaminación de las muestras.
Resistencia a agentes físicos y químicos. A pesar de no formar esporas, las micobacterias
son altamente resistentes a la desecación (12 años a 37oC en cultivos secos). Son sensibles
en cultivo a la luz solar: 2 horas de exposición les ocasiona la muerte. En esputo pueden resistir
de 20 a 30 horas de exposición solar y por 6-8 meses al abrigo de la luz solar. Las micobacterias
pierden su viabilidad por pasteurización a 62oC por 30 minutos o 72oC por 16 segundos. Son
resistentes a ácidos, álcalis y a la mayoría de los desinfectantes, excepto el formaldehído, el
glutaraldehído, el fenol y sus derivados, el etanol al 70% y, en menor grado, los hipocloritos. Esta
resistencia a agentes químicos, que se atribuye a la hidrofobicidad de sus envolturas, se
aprovecha para la decontaminación de muestras para cultivo bacteriológico provenientes de
materiales clínicos (esputo) que llevan consigo una considerable contaminación con otras
bacterias.
Mycobacterium-2
, Estructura antigénica. Las micobacterias poseen una estructura antigénica compleja. Los
antígenos más estudiados son proteínas termoestables liberadas al medio de cultivo por M.
tuberculosis. La preparación mejor conocida es la antigua tuberculina, que se obtuvo por
ebullición de cultivos de 6 semanas de incubación. El PPD (Purified Protein Derivative, derivado
proteico purificado) se obtiene al precipitar proteínas de M. tuberculosis con ácido tricloroacético o
con sulfato de amonio de un filtrado de cultivo en medio sintético. El PPD contiene proteínas en la
que predominan dos, de peso molecular 2.000 y 9.000 kDa. La purificación de los derivados
hallados en filtrado de cultivo permitió la clasificación llamada "Estados Unidos-Japón", que
incluye 11 antígenos: 1 y 2 son polisacáridos, 3 es un glucano de alto peso molecular, y de 4 a 11
son polipéptidos. Otros antígenos de M. tuberculosis son: i) polisacáridos, que no generan
hipersensibilidad retardada; ii) fosfatidil-inositol-manósidos, de dudosa utilidad para el
serodiagnóstico; iii) la cera D y el muramildipéptido, que son adyuvantes y que pueden además
desencadenar la inmunidad adaptativa celular; y iv) dimicolato de 6,6'-trehalosa (factor cuerda),
que posee actividad inmunorreactiva (adyuvante, inductor de granulomas, antitumoral y activador
del sistema del complemento por la vía alterna). No se ha encontrado un antígeno único capaz de
generar inmunidad protectora contra la infección tuberculosa ni que permita detectar la patología
cuando se lo utiliza en una prueba serodiagnóstica.
Factores de patogenicidad. Los componentes celulares de M. tuberculosis son
excepcionalmente poco tóxicos para huéspedes que no están previamente sensibilizados a la
tuberculina. M. tuberculosis carece de endo y exotoxinas. La virulencia de la bacteria se asocia a
su capacidad de multiplicarse dentro de los macrófagos a pesar de las condiciones hostiles que
allí encuentra. Los principales determinantes de patogenicidad de M. tuberculosis y su mecanismo
de acción se describen en la Tabla 1.
Tabla 1. Principales determinantes de patogenicidad de Mycobacterium tuberculosis.
Determinante Principal mecanismo de acción
Factor cuerda Es un estimulante de la respuesta inflamatoria. Debido a este factor, las micobacterias en cultivo
se agrupan formado conglomerados que asemejan a una cuerda.
Lipoarábino- Se une a los receptores de manosa de los macrófagos (M ) y promueve la penetración dentro de
manano (LAM) los mismos. Estimula la liberación de IL-8 que induce la quimiotaxis de granulocitos que
contribuyen al daño de tejido. Inhibe la activación de los (M ) por supresión de la proliferación de
los linfocitos T.
Sulfátidos Inhiben la fusión entre los lisosomas secundarios y los fagosomas y permiten la supervivencia de
M. tuberculosis dentro de los M . Promueven la liberación de TNF- , que induce daño celular y
provoca ciertos signos en el enfermo (pérdida de peso).
Ureasa, Producen la liberación de amoníaco, que alcaliniza el contenido fagolisosomal. Además, el
arginasa, amoníaco inhibe la fusión entre el fagosoma y los lisosomas. Así la micobacteria asegura su
glutaminasa y supervivencia intracelular.
asparaginasa
LECTURA COMPLEMENTARIA
El texto que sigue permite la comprensión de la patogénesis de la tuberculosis humana.
Mycobacterium tuberculosis y la tuberculosis humana
La tuberculosis es una enfermedad crónica que puede abarcar toda la vida del individuo. Sus
agentes etiológicos componen el complejo M. tuberculosis, que está integrado M. tuberculosis, M.
bovis (incluyendo al M. bovis BCG), M. africanum, M. microti y M. canettii. Este grupo presenta
una homología de ADN-ADN mayor al 95%. Los estudios de secuenciación han mostrado que las
Mycobacterium-3
Mycobacterium
Un significativo número de las especies del género Mycobacterium son prominentes patógenos,
como los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium leprae. Además,
numerosas especies de micobacterias del ambiente llamadas Mycobacterium no tuberculosos
(MNT) (antes llamadas “micobacterias atípicas”) son responsables por diversos tipos de
enfermedades, especialmente en pacientes con infección por VIH-SIDA. Las micobacterias son
objeto de estudio debido a su importantísima incidencia sobre la Salud Pública. Se conocen más
de 70 especies de Mycobacterium, entre las que aparecen algunas especies de gran importancia
médica como los agentes etiológicos de la tuberculosis humana y la lepra.
Características de las micobacterias
Morfología y tinción. Se trata de bacilos delgados, rectos o ligeramente curvos, inmóviles, que
no presentan cápsula ni forman esporas. Aunque tienen la estructura de un Gram (+), las
micobacterias casi no toman los colorantes de Gram a temperatura ambiente. Sin embargo,
pueden teñirse con fucsina
fenicada alcalina en caliente
(coloración de Ziehl-Neelsen) y
resisten la decoloración con
ácido en medio alcohólico. Esta
particularidad las define como
ácido-alcohol resistentes. La
resistencia a la decoloración se
debe al elevado contenido
lipídico de su pared celular y
sólo se pone de manifiesto si
las envolturas bacterianas
permanecen intactas.
Estructura. La envoltura de las
micobacterias consiste en una
membrana citoplasmática y
una pared celular. Esta última
presenta una gran diferencia
con la de los Gram (+), que
radica en su elevado contenido
de lípidos (60% del peso seco).
La pared de las micobacterias
contiene un grupo heterogéneo
de peptidolípidos, glicolípidos
fenólicos y sulfolípidos (sulfáti-
dos), de acción significativa y
específica en la patogénesis
(Figura 1).
Figura 1. Esquema de las envolturas de M. tuberculosis
Mycobacterium-1
,Metabolismo y cultivo. Los requerimientos nutricionales varían mucho de especie a especie de
micobacteria. Como ejemplos extremos, algunas micobacterias no patógenas del ambiente
pueden desarrollar en los picos de las canillas de agua y en lavatorios. Por el contrario, existen
otras como M. leprae, que jamás pudo ser cultivada en medios artificiales. Las micobacterias son
aerobias estrictas a punto tal que una leve disminución de la concentración de O2 produce un
marcado descenso del ritmo de crecimiento. M. tuberculosis desarrolla mejor en atmósfera de aire
con 10% de CO2. Las micobacterias crecen en medios sintéticos simples, pero para aislarlas de
algunos materiales clínicos se requieren medios selectivos sólidos especialmente adaptados, que
contienen no sólo los nutrientes, sino además inhibidores como el verde de malaquita y
antibióticos, para evitar el crecimiento de la microbiota acompañante, que crece mucho más
velozmente que las micobacterias.
Las micobacterias desarrollan muy lentamente y se requieren como mínimo de 10 a 20 días de
cultivo a 37oC para que las colonias comiencen a hacerse visibles. Compárese su tiempo medio
de generación de 15 a 20 horas, con el de la mayoría de las bacterias, que es de 30 o 40 minutos.
Algunas pocas especies, como M. fortuitum, desarrollan más rápidamente (3 a 7 días para que
una colonia se haga visible). Las micobacterias patógenas prácticamente no desarrollan a
temperatura ambiente. En los cultivos de algunas micobacterias, como las del complejo M. avium-
intracellulare, pueden observarse colonias rugosas (R, cepas virulentas) y lisas (S, avirulentas).
M. tuberculosis forma colonias elevadas, verrugosas y adherentes, de color blanquecino o
amarillento, difíciles de emulsificar debido a su alto contenido en lípidos. En ciertos medios de
cultivo las cepas virulentas se agrupan en manojos paralelos formando largos cordones
enroscados. Estos cordones también pueden ser observados en medios líquidos o en
suspensiones preparadas en agua a partir de una colonia. Esta agrupación característica se debe
a la presencia del factor cuerda.
El cultivo en medios semisólidos va cayendo en desuso en los laboratorios de Bacteriología. La
mayoría de los laboratorios hospitalarios que realizan cultivos utilizan en la actualidad sistemas
automatizados de monitoreo continuo. Mediante estos sistemas, las muestras se cultivan en
medio líquido y puede detectarse la presencia de las micobacterias tuberculosas tras apenas 5 a
14 días de cultivo, dependiendo la densidad bacteriana en la muestra inicial. El agregado de un
inhibidor del crecimiento del complejo M. tuberculosis (que incluye además de esta especie a M.
bovis y M. africanum) a un frasco de cultivo paralelo, permite una identificación preliminar rápida.
Los distintos sistemas disponibles se diferencian en el método de detección del crecimiento de las
micobacterias. El sistema BACTEC 460TB utiliza en el medio de cultivo ácido palmítico marcado
con 14C y el instrumento detecta la producción de CO2 radiactivo. Otros sistemas no utilizan
radiactivos sino la detección de fluorescencia, como el BACTEC 9000MB o BACTEC MGIT 960
(Becton Dickinson) y el MB /BacT ALERT 3D (Biomerieux). Cualquiera de estos sistemas
requiere la decontaminación de las muestras.
Resistencia a agentes físicos y químicos. A pesar de no formar esporas, las micobacterias
son altamente resistentes a la desecación (12 años a 37oC en cultivos secos). Son sensibles
en cultivo a la luz solar: 2 horas de exposición les ocasiona la muerte. En esputo pueden resistir
de 20 a 30 horas de exposición solar y por 6-8 meses al abrigo de la luz solar. Las micobacterias
pierden su viabilidad por pasteurización a 62oC por 30 minutos o 72oC por 16 segundos. Son
resistentes a ácidos, álcalis y a la mayoría de los desinfectantes, excepto el formaldehído, el
glutaraldehído, el fenol y sus derivados, el etanol al 70% y, en menor grado, los hipocloritos. Esta
resistencia a agentes químicos, que se atribuye a la hidrofobicidad de sus envolturas, se
aprovecha para la decontaminación de muestras para cultivo bacteriológico provenientes de
materiales clínicos (esputo) que llevan consigo una considerable contaminación con otras
bacterias.
Mycobacterium-2
, Estructura antigénica. Las micobacterias poseen una estructura antigénica compleja. Los
antígenos más estudiados son proteínas termoestables liberadas al medio de cultivo por M.
tuberculosis. La preparación mejor conocida es la antigua tuberculina, que se obtuvo por
ebullición de cultivos de 6 semanas de incubación. El PPD (Purified Protein Derivative, derivado
proteico purificado) se obtiene al precipitar proteínas de M. tuberculosis con ácido tricloroacético o
con sulfato de amonio de un filtrado de cultivo en medio sintético. El PPD contiene proteínas en la
que predominan dos, de peso molecular 2.000 y 9.000 kDa. La purificación de los derivados
hallados en filtrado de cultivo permitió la clasificación llamada "Estados Unidos-Japón", que
incluye 11 antígenos: 1 y 2 son polisacáridos, 3 es un glucano de alto peso molecular, y de 4 a 11
son polipéptidos. Otros antígenos de M. tuberculosis son: i) polisacáridos, que no generan
hipersensibilidad retardada; ii) fosfatidil-inositol-manósidos, de dudosa utilidad para el
serodiagnóstico; iii) la cera D y el muramildipéptido, que son adyuvantes y que pueden además
desencadenar la inmunidad adaptativa celular; y iv) dimicolato de 6,6'-trehalosa (factor cuerda),
que posee actividad inmunorreactiva (adyuvante, inductor de granulomas, antitumoral y activador
del sistema del complemento por la vía alterna). No se ha encontrado un antígeno único capaz de
generar inmunidad protectora contra la infección tuberculosa ni que permita detectar la patología
cuando se lo utiliza en una prueba serodiagnóstica.
Factores de patogenicidad. Los componentes celulares de M. tuberculosis son
excepcionalmente poco tóxicos para huéspedes que no están previamente sensibilizados a la
tuberculina. M. tuberculosis carece de endo y exotoxinas. La virulencia de la bacteria se asocia a
su capacidad de multiplicarse dentro de los macrófagos a pesar de las condiciones hostiles que
allí encuentra. Los principales determinantes de patogenicidad de M. tuberculosis y su mecanismo
de acción se describen en la Tabla 1.
Tabla 1. Principales determinantes de patogenicidad de Mycobacterium tuberculosis.
Determinante Principal mecanismo de acción
Factor cuerda Es un estimulante de la respuesta inflamatoria. Debido a este factor, las micobacterias en cultivo
se agrupan formado conglomerados que asemejan a una cuerda.
Lipoarábino- Se une a los receptores de manosa de los macrófagos (M ) y promueve la penetración dentro de
manano (LAM) los mismos. Estimula la liberación de IL-8 que induce la quimiotaxis de granulocitos que
contribuyen al daño de tejido. Inhibe la activación de los (M ) por supresión de la proliferación de
los linfocitos T.
Sulfátidos Inhiben la fusión entre los lisosomas secundarios y los fagosomas y permiten la supervivencia de
M. tuberculosis dentro de los M . Promueven la liberación de TNF- , que induce daño celular y
provoca ciertos signos en el enfermo (pérdida de peso).
Ureasa, Producen la liberación de amoníaco, que alcaliniza el contenido fagolisosomal. Además, el
arginasa, amoníaco inhibe la fusión entre el fagosoma y los lisosomas. Así la micobacteria asegura su
glutaminasa y supervivencia intracelular.
asparaginasa
LECTURA COMPLEMENTARIA
El texto que sigue permite la comprensión de la patogénesis de la tuberculosis humana.
Mycobacterium tuberculosis y la tuberculosis humana
La tuberculosis es una enfermedad crónica que puede abarcar toda la vida del individuo. Sus
agentes etiológicos componen el complejo M. tuberculosis, que está integrado M. tuberculosis, M.
bovis (incluyendo al M. bovis BCG), M. africanum, M. microti y M. canettii. Este grupo presenta
una homología de ADN-ADN mayor al 95%. Los estudios de secuenciación han mostrado que las
Mycobacterium-3
