Inleiding
Kernthema’s van methoden 3
Van één (enkele) molecule(n) naar omics
Voorbeelden Next generation sequencing
Massive parallel sequencing (Illumina)
Nanopore sequencing
Wat nanopore sequencing onderscheidt van andere sequentietechnologieën, zoals de Sanger-methode of next-
generation sequencing (NGS),
- enkel DNA-molecuul sequentieert in plaats van fragmenten van DNA.
- Deze technologie maakt gebruik van nanoporiën, kleine openingen in membranen, om de sequentie van een
enkel DNA-streng te bepalen terwijl het door de nanoporie wordt getransporteerd.
Multi-omics
Multi-omics = Multi-omics is een biologische benadering die geavanceerde technologieën inzet om gelijktijdig
een breed scala aan biologische moleculen op meerdere niveaus te onderzoeken. Dit omvat genomics,
transcriptomics, proteomics, metabolomics en epigenomics.
Van ‘bulk naar single cell’
Bulk analyse = we nemen weefsel, bv.
tumor patiënt en steken die in mixer,
geeft veel informatie (alle moleculen) →
nadeel: door de mixer is de output (data),
het gemiddelde heel complex. Alles zit
door elkaar.
Single cell omics = Cellen uit weefsel halen (alle cellen los van elkaar), 1 enkelvoudige cel van bv. Tumorcel,
kankercel,… gaan onderzoeken → voordeel: geeft me heel veel informatie, andere specifieke informatie.
Locatie van welke cel waar zit, functie van de cellen zijn ook belangrijk. Dat weet je niet bij de bul omics, maar
wel bij single cell omics. Daar weet je van ik haal 1 soort cel uit dit weefsel.
1
,Figuur 1 Voorbeeld: single cell transcriptomics
Verschillende cellen haal je uit elkaar via droplet. Elk puntje is een cel. elke cel is verschillend. Moesten alle cellen
hetzelfde zijn, zou er 1 puntje zijn bij de laatste foto.
Cellen verschillen sws van elkaar aangezien bij het kopiëren van cellen in het lichaam al rap eens wat fout gaat.
Ook in een tumor zullen alle cellen in een tumor zo verschillend, daarom kunnen tumoren gemakkelijk
ontsnappen.
Van ‘single cell’ naar ‘spatial omics’
Spatial omics = aan het weefsel niks veranderen (fruit gewoon
in fruitmand laten)
Stuk weefsel met glazen plaatje, allemaal kleine
spotjes met oligonucleotine. Dna bindt daar op en
zit een draagcode aan cellen met transcriptoon
gemeenschappelijk hebben zelfde kleur.
Figuur 2 Voorbeeld: spatial transcriptomics
Kleine deeltjes gaan sneller doorvliegen dan
grotere deeltjes. → piek groter
Figuur 3 Ander voorbeeld: mass spectrometry imaging (spatial lipidomics, proteomics, metabolomics)
Interactomics
Interactomics = interacties tussen
moleculen (interacties tussen dna en
eiwitten, eiwitten zelf,…) eiwitten
functioneren niet altijd alleen. Elk
streepje is een interactie tussen eiwitten
2
, Processen
Figuur 4 Bv gentranscriptie
Interacties tussen verschillende eiwitten → welke genen worden actief afgeschreven, welke veranderingen
vinden plaats?
Pathway analyse en fluxomics
Niet alleen steady state bekijken, ook fluxen.
We werken met gemerkte substraten C13.
C13 glucose geven aan kankerpatiënten,
kunnen we volgen welke producten worden
gemaakt, welke pathway wordt gevolgd. Zo
kan het metabolisme gevolgd worden.
Genmodulatie
Speelt dat gen/proteine, lipide die geïdentificeerd is een rol in
de ziekte → daarvoor is genmodulatie noodzakelijk
Data-integratie en databanken
Waar alle informatie wordt opgeslagen van bv. mogelijke onderzoeken
Systeembiologie
Systeembiologie is een multidisciplinaire aanpak die tot doel heeft biologische systemen in hun geheel te
begrijpen door de interacties tussen hun componenten te bestuderen op genetisch, moleculair en cellulair
niveau. Deze benadering maakt gebruik van wiskundige modellering om complexe biologische processen te
beschrijven en te voorspellen, en het heeft toepassingen in diverse gebieden, waaronder geneeskunde,
biotechnologie en ecologie, waar het kan helpen bij het ontrafelen van ziektemechanismen,
medicijnontwikkeling en milieubeheer. Systeembiologie streeft naar een holistisch begrip van biologische
complexiteit door de integratie van verschillende wetenschappelijke disciplines en computationele technieken.
Synthestische biologie
Synthetische biologie is een multidisciplinaire wetenschap die zich richt op het ontwerpen en creëren van nieuwe
biologische systemen door genetische manipulatie en engineering. Deze benadering streeft naar het
standaardiseren van biologische componenten en het bouwen van nieuwe functies zoals een LEGO-set.
Synthetische biologie heeft uiteenlopende toepassingen, variërend van biobrandstoffen en medicijnen tot
milieuremediatie en biologische sensoren, maar roept ook ethische en veiligheidskwesties op.
3
, Analyse van DNA en genomics
DNA
DNA sequentiebepaling
First-generation sequencing (1977)
• Sanger, (Maxam and Gilbert)
• cloneren (plasmiden - bacteriën): stuk dna gaan amplificeren (meer kopies) om voldoende signaal te verkrijgen
om die letters te lezen, dat gebeurt via plasmiden die we opgroeien in bacterien en op een of andere wijze
sequencen. → gebeurt niet bij second en third generation!!
• Elektroforese: dankzij deze techniek verkrijgen we analyses. je maakt fragmenten en je maakt daar kortere
fragmenten van die eindigen op een individuele base en die ga je gaan scheiden adhv een gel.
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
Stap 1: template/matrijs (groen) = clone of PCR amplicon bv van genomisch DNA-
fragment
Stap 2. polymerase + primer (complementair) + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs
(elke ddNTP met verschillende fluorescente label)
Stap 3: reactie loopt door na inbouwen dNTP
Stap 4: reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP
Stap 5: juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
Stap 6: scheiding strengen op gel of capillair → elektroferogram
Stap 7: beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen
voor betrouwbaarheid: best twee aparte reacties (FW of RV primer) om beide
richtingen af te lezen
Stap 8: Elektroferogram aflezen
o 1ste 30 bp niet afleesbaar: vaak te veel fouten
o Meestal 500-700 bp (max. tot 1000 bp) goede sequentie afleesbaar
o Software om af te lezen met kwaliteitsscores per base (Phred-score)
▪ Phred score Q = -10*log10(P) → vb: score van 10 (99% ac), 20 = 1 op 100
(99%), ev
▪ P = probabiliteit van foutieve base call
▪ → zit verwerkt in FASTQ files (zie Bioinformatica)
o Mutatiedetectie
- Niet altijd even hoge pieken
- Sequentie-fout vs mutatie? → forward en reverse reacties ter bevestiging
!! Problemen: Herhalingen van C’s en G’s in
sequentie → 3 bindingen = heel sterk → vormt
lusjes, waardoor systeem denkt dat de
sequentie korter is op gel → foutief aflezen van
gel
!! Problemen: Sequentie fout vs mutatie?:
Streng zowel reverse als forward reacties
(gebruik van 2 primers)
4
Kernthema’s van methoden 3
Van één (enkele) molecule(n) naar omics
Voorbeelden Next generation sequencing
Massive parallel sequencing (Illumina)
Nanopore sequencing
Wat nanopore sequencing onderscheidt van andere sequentietechnologieën, zoals de Sanger-methode of next-
generation sequencing (NGS),
- enkel DNA-molecuul sequentieert in plaats van fragmenten van DNA.
- Deze technologie maakt gebruik van nanoporiën, kleine openingen in membranen, om de sequentie van een
enkel DNA-streng te bepalen terwijl het door de nanoporie wordt getransporteerd.
Multi-omics
Multi-omics = Multi-omics is een biologische benadering die geavanceerde technologieën inzet om gelijktijdig
een breed scala aan biologische moleculen op meerdere niveaus te onderzoeken. Dit omvat genomics,
transcriptomics, proteomics, metabolomics en epigenomics.
Van ‘bulk naar single cell’
Bulk analyse = we nemen weefsel, bv.
tumor patiënt en steken die in mixer,
geeft veel informatie (alle moleculen) →
nadeel: door de mixer is de output (data),
het gemiddelde heel complex. Alles zit
door elkaar.
Single cell omics = Cellen uit weefsel halen (alle cellen los van elkaar), 1 enkelvoudige cel van bv. Tumorcel,
kankercel,… gaan onderzoeken → voordeel: geeft me heel veel informatie, andere specifieke informatie.
Locatie van welke cel waar zit, functie van de cellen zijn ook belangrijk. Dat weet je niet bij de bul omics, maar
wel bij single cell omics. Daar weet je van ik haal 1 soort cel uit dit weefsel.
1
,Figuur 1 Voorbeeld: single cell transcriptomics
Verschillende cellen haal je uit elkaar via droplet. Elk puntje is een cel. elke cel is verschillend. Moesten alle cellen
hetzelfde zijn, zou er 1 puntje zijn bij de laatste foto.
Cellen verschillen sws van elkaar aangezien bij het kopiëren van cellen in het lichaam al rap eens wat fout gaat.
Ook in een tumor zullen alle cellen in een tumor zo verschillend, daarom kunnen tumoren gemakkelijk
ontsnappen.
Van ‘single cell’ naar ‘spatial omics’
Spatial omics = aan het weefsel niks veranderen (fruit gewoon
in fruitmand laten)
Stuk weefsel met glazen plaatje, allemaal kleine
spotjes met oligonucleotine. Dna bindt daar op en
zit een draagcode aan cellen met transcriptoon
gemeenschappelijk hebben zelfde kleur.
Figuur 2 Voorbeeld: spatial transcriptomics
Kleine deeltjes gaan sneller doorvliegen dan
grotere deeltjes. → piek groter
Figuur 3 Ander voorbeeld: mass spectrometry imaging (spatial lipidomics, proteomics, metabolomics)
Interactomics
Interactomics = interacties tussen
moleculen (interacties tussen dna en
eiwitten, eiwitten zelf,…) eiwitten
functioneren niet altijd alleen. Elk
streepje is een interactie tussen eiwitten
2
, Processen
Figuur 4 Bv gentranscriptie
Interacties tussen verschillende eiwitten → welke genen worden actief afgeschreven, welke veranderingen
vinden plaats?
Pathway analyse en fluxomics
Niet alleen steady state bekijken, ook fluxen.
We werken met gemerkte substraten C13.
C13 glucose geven aan kankerpatiënten,
kunnen we volgen welke producten worden
gemaakt, welke pathway wordt gevolgd. Zo
kan het metabolisme gevolgd worden.
Genmodulatie
Speelt dat gen/proteine, lipide die geïdentificeerd is een rol in
de ziekte → daarvoor is genmodulatie noodzakelijk
Data-integratie en databanken
Waar alle informatie wordt opgeslagen van bv. mogelijke onderzoeken
Systeembiologie
Systeembiologie is een multidisciplinaire aanpak die tot doel heeft biologische systemen in hun geheel te
begrijpen door de interacties tussen hun componenten te bestuderen op genetisch, moleculair en cellulair
niveau. Deze benadering maakt gebruik van wiskundige modellering om complexe biologische processen te
beschrijven en te voorspellen, en het heeft toepassingen in diverse gebieden, waaronder geneeskunde,
biotechnologie en ecologie, waar het kan helpen bij het ontrafelen van ziektemechanismen,
medicijnontwikkeling en milieubeheer. Systeembiologie streeft naar een holistisch begrip van biologische
complexiteit door de integratie van verschillende wetenschappelijke disciplines en computationele technieken.
Synthestische biologie
Synthetische biologie is een multidisciplinaire wetenschap die zich richt op het ontwerpen en creëren van nieuwe
biologische systemen door genetische manipulatie en engineering. Deze benadering streeft naar het
standaardiseren van biologische componenten en het bouwen van nieuwe functies zoals een LEGO-set.
Synthetische biologie heeft uiteenlopende toepassingen, variërend van biobrandstoffen en medicijnen tot
milieuremediatie en biologische sensoren, maar roept ook ethische en veiligheidskwesties op.
3
, Analyse van DNA en genomics
DNA
DNA sequentiebepaling
First-generation sequencing (1977)
• Sanger, (Maxam and Gilbert)
• cloneren (plasmiden - bacteriën): stuk dna gaan amplificeren (meer kopies) om voldoende signaal te verkrijgen
om die letters te lezen, dat gebeurt via plasmiden die we opgroeien in bacterien en op een of andere wijze
sequencen. → gebeurt niet bij second en third generation!!
• Elektroforese: dankzij deze techniek verkrijgen we analyses. je maakt fragmenten en je maakt daar kortere
fragmenten van die eindigen op een individuele base en die ga je gaan scheiden adhv een gel.
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
Stap 1: template/matrijs (groen) = clone of PCR amplicon bv van genomisch DNA-
fragment
Stap 2. polymerase + primer (complementair) + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs
(elke ddNTP met verschillende fluorescente label)
Stap 3: reactie loopt door na inbouwen dNTP
Stap 4: reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP
Stap 5: juiste verhouding dNTPs/ddNTPs
Stap 6: scheiding strengen op gel of capillair → elektroferogram
Stap 7: beperkt tot ~500 nt, moeite met herhalingen
voor betrouwbaarheid: best twee aparte reacties (FW of RV primer) om beide
richtingen af te lezen
Stap 8: Elektroferogram aflezen
o 1ste 30 bp niet afleesbaar: vaak te veel fouten
o Meestal 500-700 bp (max. tot 1000 bp) goede sequentie afleesbaar
o Software om af te lezen met kwaliteitsscores per base (Phred-score)
▪ Phred score Q = -10*log10(P) → vb: score van 10 (99% ac), 20 = 1 op 100
(99%), ev
▪ P = probabiliteit van foutieve base call
▪ → zit verwerkt in FASTQ files (zie Bioinformatica)
o Mutatiedetectie
- Niet altijd even hoge pieken
- Sequentie-fout vs mutatie? → forward en reverse reacties ter bevestiging
!! Problemen: Herhalingen van C’s en G’s in
sequentie → 3 bindingen = heel sterk → vormt
lusjes, waardoor systeem denkt dat de
sequentie korter is op gel → foutief aflezen van
gel
!! Problemen: Sequentie fout vs mutatie?:
Streng zowel reverse als forward reacties
(gebruik van 2 primers)
4
