Examen biochemie
Experiment I : IC lokalisatie van succinaat dehydrogenase
Citroenzuurcyclus gebeurt in de mitochondriën
Succinaat dehydrogenase: succinaat -> fumaraat
FAD -> FADH2
uccinaat dehydrogenase
CooNa CooNa
CH2 CH
CH2 Complex II CH
Succinaat
dehydrogenase FADH2 CooNa
CooNa FAD
succinaat E fumaraat
E
Fe-S
Fe-S
1
, Experiment
ing van de SDH 1 SDH
activiteit in activiteit bepalenfracties
subcellulaire in subcellulaire fracties
-> via differentiële centrifugatie het homogenaat in verschillende fracties opsplitsen
!"#"$%&'(')"*++, ;',++0 &'(')"*++,
9"$*"*
-.//"$"*,.ë0" 1"*,$./2)+,." 1@,'>'0
(.,'1&'*-$.A*
3"4+0.*) #+*%-"%567%+1,.#.,".,
3"4+0.*) #+*%&",%-$''))"8.1&,
!"#$%&&%' ()'*%%' +,-&+,'
3"$"9"*.*) #+*%-"%567%+1,.#.,".,:%
µ)%;;<=)%8""/>"0=,.?->""*&".-
1. celfractionatie
• lever fijnknippen
• 20% homogenaat maken in buffer (pH 7,5) en 0,25M sucrose
o Buffer want de cellen mogen niet breken
• Potter hemogenisator: homogeniseren via Potter Elvejhem
o Cellen komen tussen stamper en glazen buis -> cellen gaan kapot en de organellen
blijven heel
• Weefsel steeds op ijs bewaren
o Proteases in de cel aanwezig (breken andere enzymes af)
o Oplossing; proteasen inhibitoren toevoegen of afkoelen
2. differentiële centrifugatie
• Hoe groter de partikel, hoe sneller de partikel neerslaat
• Organellen slaan neer bij verschillende g-kracht:
o Lage g-kracht: kernen gaan neerslaan (kern is groot en zal dus sneller neerslaan bij
kleien g)
o Hoge g-kracht: mitochondriën gaan neerslaan
3. enzym assay
Cofactor gebruiken om een kleurloos product (triphenyl tetrazolium chloride TTC)) om te zetten in
formazan vorm die rood is
2
Experiment I : IC lokalisatie van succinaat dehydrogenase
Citroenzuurcyclus gebeurt in de mitochondriën
Succinaat dehydrogenase: succinaat -> fumaraat
FAD -> FADH2
uccinaat dehydrogenase
CooNa CooNa
CH2 CH
CH2 Complex II CH
Succinaat
dehydrogenase FADH2 CooNa
CooNa FAD
succinaat E fumaraat
E
Fe-S
Fe-S
1
, Experiment
ing van de SDH 1 SDH
activiteit in activiteit bepalenfracties
subcellulaire in subcellulaire fracties
-> via differentiële centrifugatie het homogenaat in verschillende fracties opsplitsen
!"#"$%&'(')"*++, ;',++0 &'(')"*++,
9"$*"*
-.//"$"*,.ë0" 1"*,$./2)+,." 1@,'>'0
(.,'1&'*-$.A*
3"4+0.*) #+*%-"%567%+1,.#.,".,
3"4+0.*) #+*%&",%-$''))"8.1&,
!"#$%&&%' ()'*%%' +,-&+,'
3"$"9"*.*) #+*%-"%567%+1,.#.,".,:%
µ)%;;<=)%8""/>"0=,.?->""*&".-
1. celfractionatie
• lever fijnknippen
• 20% homogenaat maken in buffer (pH 7,5) en 0,25M sucrose
o Buffer want de cellen mogen niet breken
• Potter hemogenisator: homogeniseren via Potter Elvejhem
o Cellen komen tussen stamper en glazen buis -> cellen gaan kapot en de organellen
blijven heel
• Weefsel steeds op ijs bewaren
o Proteases in de cel aanwezig (breken andere enzymes af)
o Oplossing; proteasen inhibitoren toevoegen of afkoelen
2. differentiële centrifugatie
• Hoe groter de partikel, hoe sneller de partikel neerslaat
• Organellen slaan neer bij verschillende g-kracht:
o Lage g-kracht: kernen gaan neerslaan (kern is groot en zal dus sneller neerslaan bij
kleien g)
o Hoge g-kracht: mitochondriën gaan neerslaan
3. enzym assay
Cofactor gebruiken om een kleurloos product (triphenyl tetrazolium chloride TTC)) om te zetten in
formazan vorm die rood is
2
