Inhoudsopgave
BAT 1 – les 1 LC-MSMS – Introductie BAT1 ........................................................................................................ 1
BAT 1 – les 2 LC-MSMS – Introductie BAT1 ........................................................................................................ 3
BAT 1 – les 3 LC-MSMS - Vloeistofchromatografie: IC, HIC en SEC .................................................................... 7
BAT 1 – les 5 LC-MSMS - Eiwitanalyse .............................................................................................................. 13
BAT 1 – les 6 LC-MSMS - Extractie .................................................................................................................... 15
BAT 1 – les 7 LC-MSMS - Precipitatie ................................................................................................................ 17
BAT 1 – les 1 ELISA en Flowcytometrie - The basics of ELISA ............................................................................ 20
BAT 1 – les 2 ELISA en Flowcytometrie - Advanced ELISA en Flowcytometrie/FACS ......................................... 24
BAT 1 – les 3 ELISA en Flowcytometrie - PD/PK/Diagnostics + ADA’s............................................................... 28
BAT 1 – les 4 ELISA en Flowcytometrie – Flowcytometrie ................................................................................ 30
BAT 1 - les 5 ELISA en Flowcytometrie – Flowcytometrie en FACS ................................................................... 33
BAT 1 – les 1 LC-MSMS – Introductie BAT1
H1 + H3 Bionalaysis of pharmaceuticals
Bioanalyse → Het identificeren en/of kwantificeren van chemische en farmaceutische
componenten in biologisch materiaal
Wordt gemeten in biologische matrix, elke matrix heeft een andere samenstelling
Vaste matrices:
- Ontlasting → wordt alleen gebruikt als er geen andere mogelijkheden zijn
- Weefsel → bevat veel eiwitten, daarom voor onderzoek naar biomarkers
- Nagels/haar → worden gebruikt om gebruiksgeschiedenis te bepalen. Drugs of
doping verleden
Volbloed → 55% bloedplasma en 45% bloedcellen
- Bloedcellen: erythrocyten, leukocyten, trombocyten
- Anticoagulant in buis voorkomt dat het bloed gaat stollen (EDTA)
- Bewaren bij 4 graden
Bloedplasma → volbloed min de bloedcellen
- 92% water
- 7% plasma eiwitten (albumines, globulines, fibrinogenen)
- 0,9% anorganische stoffen (K, Na, Ca)
- 0,1% organische stoffen (glucose, vet, antilichamen, enzymen, hormonen)
- Na het afdraaien van volbloed bij 1000 g (10 min)
- Kan worden bewaard bij -20 of -80
- Wordt verzameld in een buis met anticoagulant (EDTA)
Serum → volbloed min de bloedcellen en stollingseiwitten
- Hetzelfde als plasma maar dan minder eiwitten
- Wordt verzameld in een buis zonder anticoagulant
- Kan ook worden bewaard bij -20 of -80
,Serum en plasma moet eerst worden afgedraaid (plasma met EDTA, serum zonder EDTA)
Plasma/serum wordt vaker gebruikt dan volbloed, behalve wanneer:
- Het analiet gebonden is aan bloedcellen
- Het analiet deel niet representatief is tussen bloedcellen en plasma
- Het monstervolume te klein is
- Het analiet stabieler is in volbloed (afbraak of modificatie in plasma)
Serum vs plasma
- Plasma wordt verkregen door het toevoegen van een antistollingsmiddel (EDTA,
natriumcitraat, heparine, kaliumoxalaat)
- Anti-coagulant kan interfemet anliet/analyse
- Geklonterd eiwit kan analiet wegvangen, dus ze zullen door serum worden
verwijderd
- Plasma bevat hoge concentraties lipiden en lipoproteïnen
- Concentratie van de meeste eiwitten (albumines, globulines) is hetzelfde in plasma
en serum (ong. 2%)
- 1 ml bloed → 500 µl plasma, 300-500 µl serum
Urine
Voordelen:
- Grote hoeveelheid sample
- Zegt iets over het metabolisme van nieren en lever
- Minder impact op de patiënt
- Relatief weinig eiwitten in urine
- Kan worden bewaard bij -20 of -80
Nadelen:
- Lagere concentraties van analiet in urine
- Groot verschil in concentraties tussen verschillende patiënten
Voorkeur gaat uit naar plasma/serum t.o.v. urine.
Samenstelling matrices → het component bepaald welk monster er wordt gebruikt, de
concentraties van de componenten verschillen namelijk in de verschillende monsters.
Interne standaard
- Toevoegen van een bekende hoeveelheid andere componenten
- Compensatie van fluctuaties van de opwerking en analyse
- Voor een betere juistheid en precisie
- Steeds vaker gelabelde componenten
Relatief piekoppervlak berekenen
Eisen van interne standaard:
- Goede scheiding tussen component en IS (chromatografie)
- Gevoelig voor verschillende golflengten (spectroscopie)
- Chemische gelijksoortig
- Concentratie IS ong. concentratie standaard
,Interne standaard zegt iets over of de analyse goed is gegaan
Deze heeft namelijk een bekende waarde
Hierdoor kunnen de duplo en triplo metingen vervallen
Isotoop gelabelde standaarden
- Labelen met detherium (D)
- Ook koolstof, normaal C12, dit wordt C13 dus 1 zwaarder dan normaal
- Toevoegen van 1 of 2 extra neutronen
- Het component reageert precies hetzelfde met de HPLC, alleen de massa verandert
- Nadeel: interne standaarden zijn duur
- D= goedkoop, maar kans op verlies van D (komt het meeste voor)
- C, N, O = stabieler, maar lastig te synthetiseren (duurder)
Hogere sensitiviteit, specificiteit en high troughput
BAT 1 – les 2 LC-MSMS – Introductie BAT1
H 4.1 t/m 4.10, H7.1 t/m 7.8 H5.7 Bionalaysis of pharmaceuticals
Mobiele fase bepaalt de naamgeving van de chromatografie.
Wat niet met LC kan worden gemeten, wordt met GC gemeten.
Scheidingsprincipe van chromatografie:
- 1e kolom = T0 = tijd van injectie (alle analieten gemengd)
- Analiet heeft interactie met stationaire fase (door bijv. waterstofbruggen of van der
Waals krachten)
- Analiet geel heeft meer interactie – tijd door kolom duurt langer
- Retentietijd = tijd die nodig is voor de analiet om door de kolom te komen
- Flow van mobiele fase heeft ook effect op de retentietijd – kan worden aangepast
Retentie
Vr (ml) = tr (min) x F (ml/min)
- Vr = retentievolume = hoeveelheid mobiele fase wat nodig is om het analiet te
elueren
, - Tr = retentietijd
- F = flow
Tm = dode tijd/ tijd van mobiele fase
- Componenten zitten in de mobiele fase (voor alle componenten gelijk)
Tr’ = tr – tm
- Tr’ = tijd in de stationaire fase = netto retentietijd
Efficiëntie
- Area van piek = oppervlakte → voor kwantitatieve analyse (A) (oppervlakte is
nauwkeuriger dan de hoogte
- Retentietijd zegt iets over het soort component → kwalificatie
- Breedte van piek → zegt iets over de selectiviteit en efficiëntie (N) van de kolom →
hoe meer interactieplaatsen des te beter de efficiëntie en scheiding van
componenten
k’ = retentiefactor = Tr’/Tm
- Voor optimalisatie
- Tussen 1 en 10
- Lager dan 1 → te dicht op de dode tijd, hoger dan 10 → duurt te lang voordat de piek
van de kolom af komt
Selectiviteit
Selectiviteitsfactor = alpha
Alpha = Tr2 / Tr1
- Er wordt geen rekening gehouden met de breedte van de piek
Resolutie
Rs = 2*(Tr2-Tr1) / W1 + W2
- > 1,5
- Hier wordt wel rekening gehouden met de breedte van de piek
- Bij 1,5 is er nog 0,2% overlap
Van Deemtercurve
- Efficiëntie van de kolom
- Net boven van optimum efficiëntie meten (hoger qua flow) → minder last van
piekverschuivingen
- A, B en C term zorgen voor piekverbreding
BAT 1 – les 1 LC-MSMS – Introductie BAT1 ........................................................................................................ 1
BAT 1 – les 2 LC-MSMS – Introductie BAT1 ........................................................................................................ 3
BAT 1 – les 3 LC-MSMS - Vloeistofchromatografie: IC, HIC en SEC .................................................................... 7
BAT 1 – les 5 LC-MSMS - Eiwitanalyse .............................................................................................................. 13
BAT 1 – les 6 LC-MSMS - Extractie .................................................................................................................... 15
BAT 1 – les 7 LC-MSMS - Precipitatie ................................................................................................................ 17
BAT 1 – les 1 ELISA en Flowcytometrie - The basics of ELISA ............................................................................ 20
BAT 1 – les 2 ELISA en Flowcytometrie - Advanced ELISA en Flowcytometrie/FACS ......................................... 24
BAT 1 – les 3 ELISA en Flowcytometrie - PD/PK/Diagnostics + ADA’s............................................................... 28
BAT 1 – les 4 ELISA en Flowcytometrie – Flowcytometrie ................................................................................ 30
BAT 1 - les 5 ELISA en Flowcytometrie – Flowcytometrie en FACS ................................................................... 33
BAT 1 – les 1 LC-MSMS – Introductie BAT1
H1 + H3 Bionalaysis of pharmaceuticals
Bioanalyse → Het identificeren en/of kwantificeren van chemische en farmaceutische
componenten in biologisch materiaal
Wordt gemeten in biologische matrix, elke matrix heeft een andere samenstelling
Vaste matrices:
- Ontlasting → wordt alleen gebruikt als er geen andere mogelijkheden zijn
- Weefsel → bevat veel eiwitten, daarom voor onderzoek naar biomarkers
- Nagels/haar → worden gebruikt om gebruiksgeschiedenis te bepalen. Drugs of
doping verleden
Volbloed → 55% bloedplasma en 45% bloedcellen
- Bloedcellen: erythrocyten, leukocyten, trombocyten
- Anticoagulant in buis voorkomt dat het bloed gaat stollen (EDTA)
- Bewaren bij 4 graden
Bloedplasma → volbloed min de bloedcellen
- 92% water
- 7% plasma eiwitten (albumines, globulines, fibrinogenen)
- 0,9% anorganische stoffen (K, Na, Ca)
- 0,1% organische stoffen (glucose, vet, antilichamen, enzymen, hormonen)
- Na het afdraaien van volbloed bij 1000 g (10 min)
- Kan worden bewaard bij -20 of -80
- Wordt verzameld in een buis met anticoagulant (EDTA)
Serum → volbloed min de bloedcellen en stollingseiwitten
- Hetzelfde als plasma maar dan minder eiwitten
- Wordt verzameld in een buis zonder anticoagulant
- Kan ook worden bewaard bij -20 of -80
,Serum en plasma moet eerst worden afgedraaid (plasma met EDTA, serum zonder EDTA)
Plasma/serum wordt vaker gebruikt dan volbloed, behalve wanneer:
- Het analiet gebonden is aan bloedcellen
- Het analiet deel niet representatief is tussen bloedcellen en plasma
- Het monstervolume te klein is
- Het analiet stabieler is in volbloed (afbraak of modificatie in plasma)
Serum vs plasma
- Plasma wordt verkregen door het toevoegen van een antistollingsmiddel (EDTA,
natriumcitraat, heparine, kaliumoxalaat)
- Anti-coagulant kan interfemet anliet/analyse
- Geklonterd eiwit kan analiet wegvangen, dus ze zullen door serum worden
verwijderd
- Plasma bevat hoge concentraties lipiden en lipoproteïnen
- Concentratie van de meeste eiwitten (albumines, globulines) is hetzelfde in plasma
en serum (ong. 2%)
- 1 ml bloed → 500 µl plasma, 300-500 µl serum
Urine
Voordelen:
- Grote hoeveelheid sample
- Zegt iets over het metabolisme van nieren en lever
- Minder impact op de patiënt
- Relatief weinig eiwitten in urine
- Kan worden bewaard bij -20 of -80
Nadelen:
- Lagere concentraties van analiet in urine
- Groot verschil in concentraties tussen verschillende patiënten
Voorkeur gaat uit naar plasma/serum t.o.v. urine.
Samenstelling matrices → het component bepaald welk monster er wordt gebruikt, de
concentraties van de componenten verschillen namelijk in de verschillende monsters.
Interne standaard
- Toevoegen van een bekende hoeveelheid andere componenten
- Compensatie van fluctuaties van de opwerking en analyse
- Voor een betere juistheid en precisie
- Steeds vaker gelabelde componenten
Relatief piekoppervlak berekenen
Eisen van interne standaard:
- Goede scheiding tussen component en IS (chromatografie)
- Gevoelig voor verschillende golflengten (spectroscopie)
- Chemische gelijksoortig
- Concentratie IS ong. concentratie standaard
,Interne standaard zegt iets over of de analyse goed is gegaan
Deze heeft namelijk een bekende waarde
Hierdoor kunnen de duplo en triplo metingen vervallen
Isotoop gelabelde standaarden
- Labelen met detherium (D)
- Ook koolstof, normaal C12, dit wordt C13 dus 1 zwaarder dan normaal
- Toevoegen van 1 of 2 extra neutronen
- Het component reageert precies hetzelfde met de HPLC, alleen de massa verandert
- Nadeel: interne standaarden zijn duur
- D= goedkoop, maar kans op verlies van D (komt het meeste voor)
- C, N, O = stabieler, maar lastig te synthetiseren (duurder)
Hogere sensitiviteit, specificiteit en high troughput
BAT 1 – les 2 LC-MSMS – Introductie BAT1
H 4.1 t/m 4.10, H7.1 t/m 7.8 H5.7 Bionalaysis of pharmaceuticals
Mobiele fase bepaalt de naamgeving van de chromatografie.
Wat niet met LC kan worden gemeten, wordt met GC gemeten.
Scheidingsprincipe van chromatografie:
- 1e kolom = T0 = tijd van injectie (alle analieten gemengd)
- Analiet heeft interactie met stationaire fase (door bijv. waterstofbruggen of van der
Waals krachten)
- Analiet geel heeft meer interactie – tijd door kolom duurt langer
- Retentietijd = tijd die nodig is voor de analiet om door de kolom te komen
- Flow van mobiele fase heeft ook effect op de retentietijd – kan worden aangepast
Retentie
Vr (ml) = tr (min) x F (ml/min)
- Vr = retentievolume = hoeveelheid mobiele fase wat nodig is om het analiet te
elueren
, - Tr = retentietijd
- F = flow
Tm = dode tijd/ tijd van mobiele fase
- Componenten zitten in de mobiele fase (voor alle componenten gelijk)
Tr’ = tr – tm
- Tr’ = tijd in de stationaire fase = netto retentietijd
Efficiëntie
- Area van piek = oppervlakte → voor kwantitatieve analyse (A) (oppervlakte is
nauwkeuriger dan de hoogte
- Retentietijd zegt iets over het soort component → kwalificatie
- Breedte van piek → zegt iets over de selectiviteit en efficiëntie (N) van de kolom →
hoe meer interactieplaatsen des te beter de efficiëntie en scheiding van
componenten
k’ = retentiefactor = Tr’/Tm
- Voor optimalisatie
- Tussen 1 en 10
- Lager dan 1 → te dicht op de dode tijd, hoger dan 10 → duurt te lang voordat de piek
van de kolom af komt
Selectiviteit
Selectiviteitsfactor = alpha
Alpha = Tr2 / Tr1
- Er wordt geen rekening gehouden met de breedte van de piek
Resolutie
Rs = 2*(Tr2-Tr1) / W1 + W2
- > 1,5
- Hier wordt wel rekening gehouden met de breedte van de piek
- Bij 1,5 is er nog 0,2% overlap
Van Deemtercurve
- Efficiëntie van de kolom
- Net boven van optimum efficiëntie meten (hoger qua flow) → minder last van
piekverschuivingen
- A, B en C term zorgen voor piekverbreding
