SAMENVATTING HEREXAMEN EINDTEST
MOBI_ALBI
ALGEMENE HANDLEIDING MOBI_ALBI (theorie) + opdracht 1 + opdracht Benchling
pet30a + opdracht 2A 2
ONDERZOEKSLIJN 1: via twee strategieën aantonen dat de aanmaak van het
expressieplasmide voor de heterologe expressie van humaan IL-1β in bacteriën, na de
ligatiestap, succesvol is 7
SOP 1: LB-agar platen gieten 8
SOP 2: Transformatie van bacteriën (SOP 1 in bijlage): 9
SOP 3: Colony PCR: 13
SOP 4 Plasmide DNA-bereiding: miniprep 17
SOP 5: restrictiedigest 21
SOP 6: agarosegelektroforese 23
ONDERZOEKSLIJN 2: het analyseren of de recombinante (heterologe) expressie van
de humane eiwitten IL-1β en EVL in bacteriën succesvol is verlopen 26
Opdracht 3 deel A: 26
Opdracht 3 deel B: recombinante tagged eiwitten, focus op de 6x His-tag 29
SOP 7 SDS-PAGE: 31
ONDERZOEKSLIJN 3: het bepalen van de concentratie van het recombinant EVL-eiwit
in zowel zuivere oplossingen als eiwitmengsels, door middel van geschikte
analysemethoden 34
SOP 8 Eiwitconcentratiebepaling: Bradford test 35
SOP 10 Detectie en kwantificatie van een eiwit van interesse in een eiwitmengsel 39
ONDERZOEKSLIJN 4: het analyseren of de transcriptie van welbepaalde genen in
menselijke cellen beïnvloed wordt na stimulatie met het cytokine IL-1β 44
Opdracht 5: 3D & 4D structuren 45
Opdracht 6, primer-design in Benchling: 48
SOP 9 RT-PCR: 52
Opdracht Benchling : pET30a expressieplasmide met insert – examenoverzicht 55
Opdracht 4: In silico klonering van IL-1β in pET30a (Benchling) 58
AFKORTINGEN & HUN VOLLEDIGE NAMEN 61
AMINOZUREN 64
SELECTIE VRAAGJES UIT INDIVIDUELE TESTEN 2025 66
,ALGEMENE HANDLEIDING MOBI_ALBI (theorie) +
opdracht 1 + opdracht Benchling pet30a + opdracht 2A
Pagina's 9 tot en met 12 van de algemene handleiding beschrijven de inhoud en werkwijze
van het onderzoek dat jullie zullen uitvoeren, met een focus op de biomoleculen die
bestudeerd worden.
3.1 Welke biomoleculen onderzoek je? Jullie zullen parallel werken met twee eiwitten en
hun corresponderende genen, coderende sequenties (CDS), mRNA- of cDNA-sequenties.
Deze twee eiwitten, Interleukine-1β (IL-1β) en Ena-Vasp-Like (EVL), hebben zeer
verschillende functies in het lichaam. Het werken met deze twee eiwitten biedt inzicht in de
diversiteit van eiwitstructuur, functie en regulatie.
● Interleukine-1β (IL-1β)
○ Definitie en functie:
■ IL-1β is een vrij klein extracellulair eiwit
■ dat behoort tot de interleukines, welke signaaleiwitten zijn die door
witte bloedcellen worden gebruikt voor communicatie.
■ Het speelt een belangrijke rol als boodschapper tussen cellen en in
het afweersysteem.
■ Het is een pro-inflammatoir cytokine dat door verschillende celtypes
wordt aangemaakt en erop inwerkt.
○ Activatie en verwerking:
■ Het IL-1β-gen (IL1B) en het bijbehorende mRNA coderen voor een
inactief voorloper-eiwit, pro-IL-1β.
■ Actief IL-1β wordt gevormd nadat het protease caspase-1 inwerkt op
pro-IL-1β, waarbij een deel van de polypeptideketen wordt verwijderd
(processing). Actief IL-1β wordt vervolgens door de cellen
gesecreteerd, hoewel het geen signaalpeptide bezit.
○ Structuur: De 3D-structuur van het mature (actieve) IL-1β-eiwit is bepaald en
bestaat uit één domein (bijvoorbeeld PDB-code 4I1B).
○ Werkingsmechanisme:
■ Actief IL-1β bindt als ligand op specifieke transmembranaire
receptoren, die een heterodimeer vormen bestaande uit de primaire
receptor IL-1R1 en de coreceptor IL-1R3 (samen het IL-1
receptorcomplex).
, ■ De binding van IL-1β aan IL-1R1 induceert een conformationele
verandering, waardoor het IL-1R1 kan binden aan IL-1R3, wat het
actieve ligand-receptorcomplex vormt.
■ Dit activeert een complexe signaalcascade in de cel, wat resulteert in
de activatie van transcriptiefactoren zoals Nucleair Factor kappa-B
(NF-κB). NF-κB verplaatst zich naar de celkern en induceert de
expressie van pro-inflammatoire genen.
○ Regulatie en klinische relevantie:
■ De pro-inflammatoire activiteit van IL-1β wordt strikt gereguleerd.
■ Een natuurlijke regulator is IL-1Ra (interleukine 1 receptor antagonist),
die competitief de IL-1R1-receptor bindt maar geen receptoractivatie
veroorzaakt, waardoor intracellulaire signalisatie wordt geblokkeerd.
■ Abnormaal verhoogde IL-1β-expressie wordt geassocieerd met
inflammatoire aandoeningen. Antagonisten van IL-1β-functie, zoals
recombinant IL-1Ra, worden klinisch gebruikt voor de behandeling
van aandoeningen zoals reumatoïde artritis en worden onderzocht
voor atherosclerose en verschillende kankers.
○ Onderzoek in het practicum: Jullie zullen experimenteel een
expressieplasmide analyseren dat codeert voor actief humaan IL-1β-eiwit en
de recombinante productie van dit eiwit in bacteriën bestuderen. Ook bepalen
jullie het resultaat van de receptoractivering op gentranscriptie in een humane
kankercel.
,
MOBI_ALBI
ALGEMENE HANDLEIDING MOBI_ALBI (theorie) + opdracht 1 + opdracht Benchling
pet30a + opdracht 2A 2
ONDERZOEKSLIJN 1: via twee strategieën aantonen dat de aanmaak van het
expressieplasmide voor de heterologe expressie van humaan IL-1β in bacteriën, na de
ligatiestap, succesvol is 7
SOP 1: LB-agar platen gieten 8
SOP 2: Transformatie van bacteriën (SOP 1 in bijlage): 9
SOP 3: Colony PCR: 13
SOP 4 Plasmide DNA-bereiding: miniprep 17
SOP 5: restrictiedigest 21
SOP 6: agarosegelektroforese 23
ONDERZOEKSLIJN 2: het analyseren of de recombinante (heterologe) expressie van
de humane eiwitten IL-1β en EVL in bacteriën succesvol is verlopen 26
Opdracht 3 deel A: 26
Opdracht 3 deel B: recombinante tagged eiwitten, focus op de 6x His-tag 29
SOP 7 SDS-PAGE: 31
ONDERZOEKSLIJN 3: het bepalen van de concentratie van het recombinant EVL-eiwit
in zowel zuivere oplossingen als eiwitmengsels, door middel van geschikte
analysemethoden 34
SOP 8 Eiwitconcentratiebepaling: Bradford test 35
SOP 10 Detectie en kwantificatie van een eiwit van interesse in een eiwitmengsel 39
ONDERZOEKSLIJN 4: het analyseren of de transcriptie van welbepaalde genen in
menselijke cellen beïnvloed wordt na stimulatie met het cytokine IL-1β 44
Opdracht 5: 3D & 4D structuren 45
Opdracht 6, primer-design in Benchling: 48
SOP 9 RT-PCR: 52
Opdracht Benchling : pET30a expressieplasmide met insert – examenoverzicht 55
Opdracht 4: In silico klonering van IL-1β in pET30a (Benchling) 58
AFKORTINGEN & HUN VOLLEDIGE NAMEN 61
AMINOZUREN 64
SELECTIE VRAAGJES UIT INDIVIDUELE TESTEN 2025 66
,ALGEMENE HANDLEIDING MOBI_ALBI (theorie) +
opdracht 1 + opdracht Benchling pet30a + opdracht 2A
Pagina's 9 tot en met 12 van de algemene handleiding beschrijven de inhoud en werkwijze
van het onderzoek dat jullie zullen uitvoeren, met een focus op de biomoleculen die
bestudeerd worden.
3.1 Welke biomoleculen onderzoek je? Jullie zullen parallel werken met twee eiwitten en
hun corresponderende genen, coderende sequenties (CDS), mRNA- of cDNA-sequenties.
Deze twee eiwitten, Interleukine-1β (IL-1β) en Ena-Vasp-Like (EVL), hebben zeer
verschillende functies in het lichaam. Het werken met deze twee eiwitten biedt inzicht in de
diversiteit van eiwitstructuur, functie en regulatie.
● Interleukine-1β (IL-1β)
○ Definitie en functie:
■ IL-1β is een vrij klein extracellulair eiwit
■ dat behoort tot de interleukines, welke signaaleiwitten zijn die door
witte bloedcellen worden gebruikt voor communicatie.
■ Het speelt een belangrijke rol als boodschapper tussen cellen en in
het afweersysteem.
■ Het is een pro-inflammatoir cytokine dat door verschillende celtypes
wordt aangemaakt en erop inwerkt.
○ Activatie en verwerking:
■ Het IL-1β-gen (IL1B) en het bijbehorende mRNA coderen voor een
inactief voorloper-eiwit, pro-IL-1β.
■ Actief IL-1β wordt gevormd nadat het protease caspase-1 inwerkt op
pro-IL-1β, waarbij een deel van de polypeptideketen wordt verwijderd
(processing). Actief IL-1β wordt vervolgens door de cellen
gesecreteerd, hoewel het geen signaalpeptide bezit.
○ Structuur: De 3D-structuur van het mature (actieve) IL-1β-eiwit is bepaald en
bestaat uit één domein (bijvoorbeeld PDB-code 4I1B).
○ Werkingsmechanisme:
■ Actief IL-1β bindt als ligand op specifieke transmembranaire
receptoren, die een heterodimeer vormen bestaande uit de primaire
receptor IL-1R1 en de coreceptor IL-1R3 (samen het IL-1
receptorcomplex).
, ■ De binding van IL-1β aan IL-1R1 induceert een conformationele
verandering, waardoor het IL-1R1 kan binden aan IL-1R3, wat het
actieve ligand-receptorcomplex vormt.
■ Dit activeert een complexe signaalcascade in de cel, wat resulteert in
de activatie van transcriptiefactoren zoals Nucleair Factor kappa-B
(NF-κB). NF-κB verplaatst zich naar de celkern en induceert de
expressie van pro-inflammatoire genen.
○ Regulatie en klinische relevantie:
■ De pro-inflammatoire activiteit van IL-1β wordt strikt gereguleerd.
■ Een natuurlijke regulator is IL-1Ra (interleukine 1 receptor antagonist),
die competitief de IL-1R1-receptor bindt maar geen receptoractivatie
veroorzaakt, waardoor intracellulaire signalisatie wordt geblokkeerd.
■ Abnormaal verhoogde IL-1β-expressie wordt geassocieerd met
inflammatoire aandoeningen. Antagonisten van IL-1β-functie, zoals
recombinant IL-1Ra, worden klinisch gebruikt voor de behandeling
van aandoeningen zoals reumatoïde artritis en worden onderzocht
voor atherosclerose en verschillende kankers.
○ Onderzoek in het practicum: Jullie zullen experimenteel een
expressieplasmide analyseren dat codeert voor actief humaan IL-1β-eiwit en
de recombinante productie van dit eiwit in bacteriën bestuderen. Ook bepalen
jullie het resultaat van de receptoractivering op gentranscriptie in een humane
kankercel.
,
