Instrumentele technologie
Inhoud
Hoofdstuk 4: Scheidingstechnieken........................................................................................................2
1. Staalvoorbereiding..........................................................................................................................2
2. Chromatografie...............................................................................................................................2
2.1. Inleiding...................................................................................................................................2
2.2. Chromatografische parameters...............................................................................................3
2.3. Principe van verdelingschromatografie....................................................................................3
2.4. Piekparameters........................................................................................................................3
2.5. Scheidingsvariabele.................................................................................................................5
2.6. Kolomafhankelijke parameters................................................................................................6
2.7. Vloeistofchromatografie (HPLC)...............................................................................................7
2.8. Gaschromatografie................................................................................................................11
3. Capillaire elektroforese.................................................................................................................16
3.1. Elektro-osmotische flow (EOF)...............................................................................................16
3.2. Apparatuur.............................................................................................................................18
3.3. Elektrogedreven Scheidingen.................................................................................................18
Hoofdstuk 5: kwaliteitszorg..................................................................................................................21
1. Wat is kwaliteit?...........................................................................................................................21
2. Wat is kwaliteitszorg?...................................................................................................................22
2.1. Gestructureerd problemen oplossen.....................................................................................23
3. Kwaliteitssystemen vastleggen en beoordelen.............................................................................24
3.1. Kwaliteitsnormen...................................................................................................................24
3.2. Validatie van resultaten.........................................................................................................28
Hoofdstuk 6: Methoden validatie........................................................................................................34
1. Validatie van meetinstrumenten...................................................................................................34
1.2. De juistheid............................................................................................................................34
1.3. De precisie.............................................................................................................................36
2. Methoden ontwikkeling + optimalisatie.......................................................................................37
3. Lineariteit......................................................................................................................................39
4. LOD en LOQ...................................................................................................................................41
5. Selectiviteit en specificiteit...........................................................................................................43
6. Methode validatie.........................................................................................................................44
VI.1. Methode vergelijking............................................................................................................44
1
,Hoofdstuk 4: Scheidingstechnieken
1. Staalvoorbereiding
Zie geschreven samenvatting
2. Chromatografie
2.1. Inleiding
= analytische scheidingsmethodes die ervoor zorgen dat een mengsel van stoffen gescheiden kunnen
worden in zijn samenstellende componenten
Alle technieken steunen op 2 fasen:
- Stationaire fase, blijft op zijn plaats
- Mobiele fase, stroomt langs de stationaire fase
Scheiding gebeurd door de snelheid waarmee de componenten doorheen het systeem meegevoerd
worden
Afhankelijk van de karakters van de componenten wordt een chromatografisch systeem gebruikt
Verdelingschromatografie/partitiechromatografie
Analiet lost op in het eluent en de stationaire fase
Verdeling gebaseerd op: verschil in oplossingsconstanten
Absorptiechromatografie
Analiet lost op in het eluent maar absorbeert via fysische interacties met de stationaire fase
Component het sterkste gebonden aan de stationaire fase, worden het meest
afgeremd meestal speelt polariteit een rol
Indeling chromatografie naar fasen:
Mobiele fase Stationaire fase Type Lettercode Benaming
Gas Vloeistof Verdeling GLC Gas-vloeistof-
chromatografie
Gas Vast Absorptie CSC Gas-vast-
chromatografie
Vloeistof Vloeistof Verdeling LLC Vloeistof-
vloeistof-
chromatografie
Vloeistof Vast Absorptie LSC Vloeistof-vast-
chromatografie
Scheiding volgens de grootte Moleculaire exclusiechromatografie
Bv. bij DNA
Afhankelijk van de mobiele fase tussen de gelfiltratie of gelpermeabiliteit
Ionenuitwisseling
Geladen deeltjes die aantrekking of afstoting geven
Stationaire fase= dragermateriaal met ionen
Verdeling gebaseerd op: ionisatie
Micro-analytische techniek heeft als doel:
2
, - De samenstelling van het mengsel bepalen
=> Planaire chromatografie
=> gepakte kolom => capillaire kolom
Preparatieve chromatografie heeft als doel:
- Zuivere componenten isoleren
=> SPE
2.2. Chromatografische parameters
2.3. Principe van verdelingschromatografie
Nernst bewees dat:
Een opgeloste stof zich over 2 mengbare of niet mengbare oplosmiddelen verdeelt in een constante
verhouding. Componenten verdelen zich in de stationaire en de mobiele fase
Concentratie ∈fase I Concentratie stationaire fase
K= =
Concentratie∈ fase II Concentratie mobiele fase
K= Verdelingscoëfficiënt
Component weinig oplosbaar in de
stationaire fase= snel uit de kolom= kleine K
Component goed oplosbaar in de
stationaire fase= traag uit de kolom= grote K
2.4. Piekparameters
Mobiele fase gas gaschromatografie
3
, Mobiele fase vloeistof vloeistofchromatografie
2.4.1. Retentietijd, nettoretentietijd, dood volume en capaciteitsfactor
t0
Tijd t0= de tijd dat een onvertraagd component nodig heeft om de kolom te doorlopen van het
beginpunt tot het eindpunt= “dode” tijd
Punt B= het maximum van de piek
Plaats van de piek in een chromatogram wordt weergegeven door 2 parameters:
- Retentietijd tR= de tijd tussen de injectie en piekmaximum van het component
- Nettoretentietijd/gecorrigeerde retentietijd tR’= de tijd tussen innert gas en piekmaximum
van het component (afstand A en B)
Dit duidt dus aan in welke mate een component wordt tegengehouden door de stationaire
fase
Weerspiegelt de capaciteit van de kolom om analiet A te weerhouden en is gerelateerd aan de
verdelingscoëfficiënt= capaciteitsfactor:
Volume ∈fase I Volume∈stationaire fase
k’= =
Volume∈fase II Volume∈mobiele fase
k’= Capaciteitsfactor
t R ( A )−t 0
k’= =
t0
k’ voor elke component tussen de 1-5= ideaal
k’= te hoog tijd van de analyse verhoogt k’= te laag= resolutie, de scheiding zal slecht verlopen zijn
Theoretische voorstelling van een kolom:
- Stof a wordt door een gasstroom
in het compartimentje gebracht
- Gasstroom stopt even en de stof a
verdeeld zich over de 2 fasen
volgens ka’ en Ka’= de
evenwichtsinstelling
4
Inhoud
Hoofdstuk 4: Scheidingstechnieken........................................................................................................2
1. Staalvoorbereiding..........................................................................................................................2
2. Chromatografie...............................................................................................................................2
2.1. Inleiding...................................................................................................................................2
2.2. Chromatografische parameters...............................................................................................3
2.3. Principe van verdelingschromatografie....................................................................................3
2.4. Piekparameters........................................................................................................................3
2.5. Scheidingsvariabele.................................................................................................................5
2.6. Kolomafhankelijke parameters................................................................................................6
2.7. Vloeistofchromatografie (HPLC)...............................................................................................7
2.8. Gaschromatografie................................................................................................................11
3. Capillaire elektroforese.................................................................................................................16
3.1. Elektro-osmotische flow (EOF)...............................................................................................16
3.2. Apparatuur.............................................................................................................................18
3.3. Elektrogedreven Scheidingen.................................................................................................18
Hoofdstuk 5: kwaliteitszorg..................................................................................................................21
1. Wat is kwaliteit?...........................................................................................................................21
2. Wat is kwaliteitszorg?...................................................................................................................22
2.1. Gestructureerd problemen oplossen.....................................................................................23
3. Kwaliteitssystemen vastleggen en beoordelen.............................................................................24
3.1. Kwaliteitsnormen...................................................................................................................24
3.2. Validatie van resultaten.........................................................................................................28
Hoofdstuk 6: Methoden validatie........................................................................................................34
1. Validatie van meetinstrumenten...................................................................................................34
1.2. De juistheid............................................................................................................................34
1.3. De precisie.............................................................................................................................36
2. Methoden ontwikkeling + optimalisatie.......................................................................................37
3. Lineariteit......................................................................................................................................39
4. LOD en LOQ...................................................................................................................................41
5. Selectiviteit en specificiteit...........................................................................................................43
6. Methode validatie.........................................................................................................................44
VI.1. Methode vergelijking............................................................................................................44
1
,Hoofdstuk 4: Scheidingstechnieken
1. Staalvoorbereiding
Zie geschreven samenvatting
2. Chromatografie
2.1. Inleiding
= analytische scheidingsmethodes die ervoor zorgen dat een mengsel van stoffen gescheiden kunnen
worden in zijn samenstellende componenten
Alle technieken steunen op 2 fasen:
- Stationaire fase, blijft op zijn plaats
- Mobiele fase, stroomt langs de stationaire fase
Scheiding gebeurd door de snelheid waarmee de componenten doorheen het systeem meegevoerd
worden
Afhankelijk van de karakters van de componenten wordt een chromatografisch systeem gebruikt
Verdelingschromatografie/partitiechromatografie
Analiet lost op in het eluent en de stationaire fase
Verdeling gebaseerd op: verschil in oplossingsconstanten
Absorptiechromatografie
Analiet lost op in het eluent maar absorbeert via fysische interacties met de stationaire fase
Component het sterkste gebonden aan de stationaire fase, worden het meest
afgeremd meestal speelt polariteit een rol
Indeling chromatografie naar fasen:
Mobiele fase Stationaire fase Type Lettercode Benaming
Gas Vloeistof Verdeling GLC Gas-vloeistof-
chromatografie
Gas Vast Absorptie CSC Gas-vast-
chromatografie
Vloeistof Vloeistof Verdeling LLC Vloeistof-
vloeistof-
chromatografie
Vloeistof Vast Absorptie LSC Vloeistof-vast-
chromatografie
Scheiding volgens de grootte Moleculaire exclusiechromatografie
Bv. bij DNA
Afhankelijk van de mobiele fase tussen de gelfiltratie of gelpermeabiliteit
Ionenuitwisseling
Geladen deeltjes die aantrekking of afstoting geven
Stationaire fase= dragermateriaal met ionen
Verdeling gebaseerd op: ionisatie
Micro-analytische techniek heeft als doel:
2
, - De samenstelling van het mengsel bepalen
=> Planaire chromatografie
=> gepakte kolom => capillaire kolom
Preparatieve chromatografie heeft als doel:
- Zuivere componenten isoleren
=> SPE
2.2. Chromatografische parameters
2.3. Principe van verdelingschromatografie
Nernst bewees dat:
Een opgeloste stof zich over 2 mengbare of niet mengbare oplosmiddelen verdeelt in een constante
verhouding. Componenten verdelen zich in de stationaire en de mobiele fase
Concentratie ∈fase I Concentratie stationaire fase
K= =
Concentratie∈ fase II Concentratie mobiele fase
K= Verdelingscoëfficiënt
Component weinig oplosbaar in de
stationaire fase= snel uit de kolom= kleine K
Component goed oplosbaar in de
stationaire fase= traag uit de kolom= grote K
2.4. Piekparameters
Mobiele fase gas gaschromatografie
3
, Mobiele fase vloeistof vloeistofchromatografie
2.4.1. Retentietijd, nettoretentietijd, dood volume en capaciteitsfactor
t0
Tijd t0= de tijd dat een onvertraagd component nodig heeft om de kolom te doorlopen van het
beginpunt tot het eindpunt= “dode” tijd
Punt B= het maximum van de piek
Plaats van de piek in een chromatogram wordt weergegeven door 2 parameters:
- Retentietijd tR= de tijd tussen de injectie en piekmaximum van het component
- Nettoretentietijd/gecorrigeerde retentietijd tR’= de tijd tussen innert gas en piekmaximum
van het component (afstand A en B)
Dit duidt dus aan in welke mate een component wordt tegengehouden door de stationaire
fase
Weerspiegelt de capaciteit van de kolom om analiet A te weerhouden en is gerelateerd aan de
verdelingscoëfficiënt= capaciteitsfactor:
Volume ∈fase I Volume∈stationaire fase
k’= =
Volume∈fase II Volume∈mobiele fase
k’= Capaciteitsfactor
t R ( A )−t 0
k’= =
t0
k’ voor elke component tussen de 1-5= ideaal
k’= te hoog tijd van de analyse verhoogt k’= te laag= resolutie, de scheiding zal slecht verlopen zijn
Theoretische voorstelling van een kolom:
- Stof a wordt door een gasstroom
in het compartimentje gebracht
- Gasstroom stopt even en de stof a
verdeeld zich over de 2 fasen
volgens ka’ en Ka’= de
evenwichtsinstelling
4
