Biotechnologie I
Inhoud
Deel III: Transcriptie................................................................................................................................3
Hoofdstuk 11: Samenstelling, structuur en voorkomen van RNA.......................................................3
11.1 Samenstelling..........................................................................................................................3
11.2 Algemene structuur................................................................................................................3
11.3 Voorkomen.............................................................................................................................3
11.4 Belangrijke RNA-manipulerende enzymen.............................................................................3
Hoofdstuk 12: Transcriptie bij prokaryoten versus bij eukaryoten......................................................3
12.1 Transcriptie bij prokaryoten....................................................................................................3
12.2 Transcriptie van de eukaryoten...............................................................................................6
Hoofdstuk 13: Transfer RNA (tRNA)....................................................................................................8
13.2 De structuur............................................................................................................................8
13.3 Koppeling van het aminozuur...............................................................................................10
13.4 Pre-tRNA...............................................................................................................................11
Hoofdstuk 14: Ribosomaal RNA (rRNA)............................................................................................11
14.2 Ribosomen............................................................................................................................11
14.3 Prokaryotische ribosomen....................................................................................................11
14.4 Eukaryotische ribosomen......................................................................................................12
Hoofdstuk 15: Boodschapper RNA (mRNA).....................................................................................13
Hoofdstuk 16: Splicing van prematuur RNA......................................................................................14
16.2 Mechanisme van RNA-splicing..............................................................................................15
Hoofdstuk 17: Andere soorten RNA..................................................................................................16
17.1 Small nuclear RNA en Long non-coding RNA........................................................................16
17.2 Micro RNA (miRNA)..............................................................................................................16
Deel IV: Technieken...............................................................................................................................19
Hoofdstuk 18: Omgaan met RNA......................................................................................................19
Hoofdstuk 19: Concentratiebepaling RNA........................................................................................20
Hoofdstuk 20: Isolatie van RNA.........................................................................................................21
Hoofdstuk 21: kwaliteitscontrole RNA..............................................................................................22
Hoofdstuk 22: Boodschapper RNA omzetten naar complementair DNA..........................................23
Hoofstuk 23: Isolatie specifieke soorten RNA...................................................................................25
Hoofdstuk 23: In vitro transcriptie/translatie...................................................................................26
Deel V: DNA replicatie...........................................................................................................................27
1
, Hoofdstuk 25: Replicatie van DNA....................................................................................................27
25.1 DNA-replicatie gebeurt semiconservatief.............................................................................28
25.2 DNA-replicatie gebeurt meestal bidirectioneel.....................................................................28
25.3 DNA-replicatie door middel van DNA-polymerasen..............................................................30
25.4 Een groeivork heeft een continue leading en een discontinue lagging streng......................30
25.5 Overzicht van de voornaamste enzymen betrokken bij de DNA-replicatie...........................31
25.6 De oorsprong van replicatie..................................................................................................32
25.7 Rolling circles als alternatieve replicatiewijze.......................................................................32
25.8 DNA-polymerase van een eukaryoot....................................................................................33
Deel VI: Replicatietechnieken...............................................................................................................33
Hoofstuk 26: Polymerase chain reaction (PCR).................................................................................33
26.2 Reactievoorwaarden.............................................................................................................34
26.3 Toepassingen........................................................................................................................39
Hoofdstuk 27: Afgeleide PCR technieken..........................................................................................40
27.1 Specificiteit van PCR opdrijven door de PCR lichtelijk te wijzigen.........................................40
27.2 RT-PCR...................................................................................................................................40
27.3 Multiplex PCR........................................................................................................................43
27.4 Long range PCR.....................................................................................................................44
27.5 RFLP-PCR en AS-PCR..............................................................................................................44
27.6 AFLP-PCR...............................................................................................................................48
27.7 RAPD.....................................................................................................................................49
27.8 Methylspecifieke PCR............................................................................................................50
27.9 Mutaties aanbrengen via primers.........................................................................................51
Hoofdstuk 28: Kwantitatieve PCR (qPCR)..........................................................................................54
28.1 Berekeningen voor relatieve/absolute kwantificatie.............................................................56
28.2 DNA detectormolecule.........................................................................................................59
Hoofdstuk 29: Droplet digital PCR (ddPCR).......................................................................................65
2
,Deel III: Transcriptie
Hoofdstuk 11: Samenstelling, structuur en voorkomen van RNA
11.1 Samenstelling
RNA is opgebouwd uit:
Ribonucleotiden opgebouwd uit:
- Heterocyclische base: adenine, guanine, cytrosine of uracil
- Ribose
D-ribose
- Fosfaatgroep
11.2 Algemene structuur
RNA= bijna altijd lineair en enkelstrengig
Een secundaire structuur door hun korte dubbelhelicale gebieden
Tertaire structuur sommige RNA’s (bv.rRNA)
Stabiliteit is te danken aan:
- G-C gehalte
- Ionensterkte
- Lengte van de secundaire structuur gebieden
11.3 Voorkomen
Bij prokaryoten, 3 soorten RNA’s:
- mRNA, messenger RNA het minste aanwezig
- rRNA, ribosomaal RNA het meeste aanwezig
- tRNA, transfer RNA
Bij eukaryoten, 4 soorten RNA’s:
- mRNA
- rRNA
- tRNA
- hnRNA, heterogeen nucleair RNA
RNA kan de functie van een genoom vervullen zowel ss als ds
11.4 Belangrijke RNA-manipulerende enzymen
RNA polymerase
Vormt de RNA ketting
RNase
Kan specifiek RNA afbreken
Reverse transcriptase
Schrijft een RNA matrijs over naar het complementair DNA
Hoofdstuk 12: Transcriptie bij prokaryoten versus bij eukaryoten
12.1 Transcriptie bij prokaryoten
12.1.1 Mechanisme
Synthese van RNA
3
, 1 type RNA-polymerasen
- RNA-polymerase gebruikt 1 van de DNA strengen als template en vertaald dit
Niet noodzakelijk altijd dezelfde streng binnen een genoom
- Geen primer nodig
- Synthese gebeurt van 5’ naar 3’
3 fasen in de transcriptie:
1) Initiatie (geïnhibeerd door rifampicine)
2) Elongatie (geïnhibeerd door streptolygidin)
3) Terminatie
12.1.2 Het bacterieel RNA-polymerase
RNA-polymerase is een enzymcomplex
- Holo-enzym bevat 5 verschillende polypeptide ketens
β’ DNA binding
β bindingsplaats voor rifampicine en streptolygidin
ℴ interactie is zeer zwak
α komt 2 maal voor, de rest maar 1 maal
ω behouden van de structurele conformatie van β’ en rekrutering
RNA-polymerase zonder ℴ subeenheid= core-enzym
12.1.3 Initiatie van transcriptie: promotors
De ℴ speelt enkel een belangrijke rol in de herkenning van de start van het DNA en dus het opstarten
van de transcriptie
Startplaatsen= promotors (sequentie, geen base)
Transcriptie start met holo-enzym, daarna enkel core-enzym nodig
Promotor:
+1= de startplaats
-10= pribnow box (2e gebied) RNA-polymerase bind top het DNA
-35= (3e gebied)
Sterke promotor bevat ook nog een -43 gebied= AT-rijk gebied
Mechanisme van de initiatie
Beginselen van de transcriptie
4
Inhoud
Deel III: Transcriptie................................................................................................................................3
Hoofdstuk 11: Samenstelling, structuur en voorkomen van RNA.......................................................3
11.1 Samenstelling..........................................................................................................................3
11.2 Algemene structuur................................................................................................................3
11.3 Voorkomen.............................................................................................................................3
11.4 Belangrijke RNA-manipulerende enzymen.............................................................................3
Hoofdstuk 12: Transcriptie bij prokaryoten versus bij eukaryoten......................................................3
12.1 Transcriptie bij prokaryoten....................................................................................................3
12.2 Transcriptie van de eukaryoten...............................................................................................6
Hoofdstuk 13: Transfer RNA (tRNA)....................................................................................................8
13.2 De structuur............................................................................................................................8
13.3 Koppeling van het aminozuur...............................................................................................10
13.4 Pre-tRNA...............................................................................................................................11
Hoofdstuk 14: Ribosomaal RNA (rRNA)............................................................................................11
14.2 Ribosomen............................................................................................................................11
14.3 Prokaryotische ribosomen....................................................................................................11
14.4 Eukaryotische ribosomen......................................................................................................12
Hoofdstuk 15: Boodschapper RNA (mRNA).....................................................................................13
Hoofdstuk 16: Splicing van prematuur RNA......................................................................................14
16.2 Mechanisme van RNA-splicing..............................................................................................15
Hoofdstuk 17: Andere soorten RNA..................................................................................................16
17.1 Small nuclear RNA en Long non-coding RNA........................................................................16
17.2 Micro RNA (miRNA)..............................................................................................................16
Deel IV: Technieken...............................................................................................................................19
Hoofdstuk 18: Omgaan met RNA......................................................................................................19
Hoofdstuk 19: Concentratiebepaling RNA........................................................................................20
Hoofdstuk 20: Isolatie van RNA.........................................................................................................21
Hoofdstuk 21: kwaliteitscontrole RNA..............................................................................................22
Hoofdstuk 22: Boodschapper RNA omzetten naar complementair DNA..........................................23
Hoofstuk 23: Isolatie specifieke soorten RNA...................................................................................25
Hoofdstuk 23: In vitro transcriptie/translatie...................................................................................26
Deel V: DNA replicatie...........................................................................................................................27
1
, Hoofdstuk 25: Replicatie van DNA....................................................................................................27
25.1 DNA-replicatie gebeurt semiconservatief.............................................................................28
25.2 DNA-replicatie gebeurt meestal bidirectioneel.....................................................................28
25.3 DNA-replicatie door middel van DNA-polymerasen..............................................................30
25.4 Een groeivork heeft een continue leading en een discontinue lagging streng......................30
25.5 Overzicht van de voornaamste enzymen betrokken bij de DNA-replicatie...........................31
25.6 De oorsprong van replicatie..................................................................................................32
25.7 Rolling circles als alternatieve replicatiewijze.......................................................................32
25.8 DNA-polymerase van een eukaryoot....................................................................................33
Deel VI: Replicatietechnieken...............................................................................................................33
Hoofstuk 26: Polymerase chain reaction (PCR).................................................................................33
26.2 Reactievoorwaarden.............................................................................................................34
26.3 Toepassingen........................................................................................................................39
Hoofdstuk 27: Afgeleide PCR technieken..........................................................................................40
27.1 Specificiteit van PCR opdrijven door de PCR lichtelijk te wijzigen.........................................40
27.2 RT-PCR...................................................................................................................................40
27.3 Multiplex PCR........................................................................................................................43
27.4 Long range PCR.....................................................................................................................44
27.5 RFLP-PCR en AS-PCR..............................................................................................................44
27.6 AFLP-PCR...............................................................................................................................48
27.7 RAPD.....................................................................................................................................49
27.8 Methylspecifieke PCR............................................................................................................50
27.9 Mutaties aanbrengen via primers.........................................................................................51
Hoofdstuk 28: Kwantitatieve PCR (qPCR)..........................................................................................54
28.1 Berekeningen voor relatieve/absolute kwantificatie.............................................................56
28.2 DNA detectormolecule.........................................................................................................59
Hoofdstuk 29: Droplet digital PCR (ddPCR).......................................................................................65
2
,Deel III: Transcriptie
Hoofdstuk 11: Samenstelling, structuur en voorkomen van RNA
11.1 Samenstelling
RNA is opgebouwd uit:
Ribonucleotiden opgebouwd uit:
- Heterocyclische base: adenine, guanine, cytrosine of uracil
- Ribose
D-ribose
- Fosfaatgroep
11.2 Algemene structuur
RNA= bijna altijd lineair en enkelstrengig
Een secundaire structuur door hun korte dubbelhelicale gebieden
Tertaire structuur sommige RNA’s (bv.rRNA)
Stabiliteit is te danken aan:
- G-C gehalte
- Ionensterkte
- Lengte van de secundaire structuur gebieden
11.3 Voorkomen
Bij prokaryoten, 3 soorten RNA’s:
- mRNA, messenger RNA het minste aanwezig
- rRNA, ribosomaal RNA het meeste aanwezig
- tRNA, transfer RNA
Bij eukaryoten, 4 soorten RNA’s:
- mRNA
- rRNA
- tRNA
- hnRNA, heterogeen nucleair RNA
RNA kan de functie van een genoom vervullen zowel ss als ds
11.4 Belangrijke RNA-manipulerende enzymen
RNA polymerase
Vormt de RNA ketting
RNase
Kan specifiek RNA afbreken
Reverse transcriptase
Schrijft een RNA matrijs over naar het complementair DNA
Hoofdstuk 12: Transcriptie bij prokaryoten versus bij eukaryoten
12.1 Transcriptie bij prokaryoten
12.1.1 Mechanisme
Synthese van RNA
3
, 1 type RNA-polymerasen
- RNA-polymerase gebruikt 1 van de DNA strengen als template en vertaald dit
Niet noodzakelijk altijd dezelfde streng binnen een genoom
- Geen primer nodig
- Synthese gebeurt van 5’ naar 3’
3 fasen in de transcriptie:
1) Initiatie (geïnhibeerd door rifampicine)
2) Elongatie (geïnhibeerd door streptolygidin)
3) Terminatie
12.1.2 Het bacterieel RNA-polymerase
RNA-polymerase is een enzymcomplex
- Holo-enzym bevat 5 verschillende polypeptide ketens
β’ DNA binding
β bindingsplaats voor rifampicine en streptolygidin
ℴ interactie is zeer zwak
α komt 2 maal voor, de rest maar 1 maal
ω behouden van de structurele conformatie van β’ en rekrutering
RNA-polymerase zonder ℴ subeenheid= core-enzym
12.1.3 Initiatie van transcriptie: promotors
De ℴ speelt enkel een belangrijke rol in de herkenning van de start van het DNA en dus het opstarten
van de transcriptie
Startplaatsen= promotors (sequentie, geen base)
Transcriptie start met holo-enzym, daarna enkel core-enzym nodig
Promotor:
+1= de startplaats
-10= pribnow box (2e gebied) RNA-polymerase bind top het DNA
-35= (3e gebied)
Sterke promotor bevat ook nog een -43 gebied= AT-rijk gebied
Mechanisme van de initiatie
Beginselen van de transcriptie
4
