Samenvatting Inleiding tot biotechnologie en genetica (prof Deforce)

H1 : Inleiding
Biotechnologie: gebruik & manipulatie van biologische systemen ter bereiding natuurlijke
grondstoffen en biomassa
Biologisch systemen: micro-org; plantaardige/dierlijke cellen; enzymen geïsoleerd uit een
levend wezen
Niet: traditionele agricultuur en veeteelt
Fermentatie: synoniem voor gisting. Dit is de afbraak van organische stof zonder
tussenkomst van zuurstof (anaeroob)

Eerste periode
-Prehistorie-1850
-Onbewust gebruik van bacteriën en gisten bij de productie van levensmiddelen

Tweede periode
-Vanaf 1850
-Louis Pasteur ontdekt dat micro-org verantw zijn voor bepaalde chemische omzettingen
-Uitsluiting van contaminaties nog niet mogelijk

Derde periode
-Gebruik van aseptische technieken  zuivere culturen
-Farmaceutische productie penicilline

Vierde periode
-Invoer recombinant DNA-technieken
-Doorbraak plant/dierlijke celculturen in productieprocessen

Biotechnologie ≠ recombinant DNA-technieken
- Biotechnologie is veel meer dan recombinant -DNA: Recom-DNA is een vb, een onderklasse

DNA manipuleren
-Gemanipuleerd DNA wordt op stabiele wijze in genoom ingebracht
-aanmaak specifieke eiwitten in industrielichaamseigen mol in grote hoeveelheden
gebruik:
1) neuro-endocriene boodschappers, lymfokines & bloedeiwitten
2) vaccins, monoklonale antilichamen & enzymen

Biologicals
=complex gnm…
-GEEN Klassiek gnm: via chemische synthese aangemaakt
-subklasse: biotech gnm: vb Insuline
 Varkensinsuline: verschilt 1 AZ met humaan insuline
Immunogeniciteit
Risico op contaminaties met virale infecties

,  Biotech insuline: geproduceerd in bacteriën. = humaan
insuline. Continue bron zonder risico op contaminaties

H2: Basisbegrippen/ technieken
in biotechnologie en genetica
2.1 DNA-RNA
2.1.1 DNA-structuur

 Primaire structuur: polynucleotide-structuur
 Polynucleotide:

à3’-5’-fosfordiëster binding tss nucleotide àsuiker-fosfaatskelet -> base gebonden op
C1’

 Secundaire structuur: 2 anti-parallele ketens = Watson & Crick model

àH-bruggen tss complementaire base( A-T en G-C)

àChargaffregel:

 Virussen : enkelstrenig DNA
àzelf complementariteitàvorming dubbele helix haarspeld structuur

 Circulair DNA: bacteriële genomen, virussen, bacteriofagen
& plasmiden
-replicatie plasmide-DNA onafh. van replicatie bacterieel DNA
àOnevenredige verdeling van DNA over dochtercellen

2.1.2 Denaturatie-Renaturatie

 Denaturatie
-thermisch (verwarmen)
-PH wijziging (sterk zuur/alkalisch)
-destabilisatie ureum/formamide: DNA gedurende langere periode enkelstrengig
houden
 Reversibel proces
(↔ denaturatie van eiwitten = irreversibel proces)

o Tm-waarde/Tsmelt
= T waarbij helft basen in een duplex ongepaard zijn

àkenmerken
stijgt bij ↑ [G][T] gehalte : Meer H-bruggen ( GT: 3 H-bruggen ↔ AT: 2 H-bruggen)

, o Renaturatie
= bij temp 25 °C onder Tm-waarde

 Detectie denaturatie: UV spectrofotometrie
o 260nm
o Dubbelstrenig:absorbeert minder bij 260nm
o Enkelstrenig:absorbeert meer bij 260nm
àBasen zijn verantw. voor UV-absorptie: door elkaars nabijheid in dubbelstreng
wordt absorbantie onderdrukt
o Tm:waar grafiek verticale stijging heeft
 Detectie hoeveelheid DNA + onzuiverheden
1 OD (260 nm) = 50 μg/ml dubbesltrengig DNA
= 33 μg/ml enkelstrengig DNA
Zuivere DNA preparaten OD(260 nm)/OD(280 nm) = 1,8
à Afwijkend getal: onzuiver
à Er bestaan onzuiverheden die de afwijking zullen opheffen


Homologe renaturatie Heterologe renaturatie
Met een volledig compl. stuk identiek DNA Met een niet volledig identiek of
compl stuk DNA
Sneller indien conc. hoger Per mismatch daalt Tm met 1,4 gr
Kationen:↓elektrostatischafstoting
->renat->hogereTm




2.1.2 DNA-Replicatie

- Snelheid: 50-nucleotiden per sec
- Basisprincipe: DNA-baseparing & DNA-templating
- Enzym: DNA-polymerase
- dNTPs: deoxyribonucleotidetrifosfaten
- semi-conservatief: oude streng krijgt nieuwe streng


à replicatievork: asymetrisch -> leading & lagging streng
ontstaan: origins of replication (= DNA-seq 300 nucleotiden AT-rijk)
à initiator eiwit: binden hierop -> DNA-seq herkennen
à DNA-helicasen: binden aan initiator eiwit en halen dubbele helix uit elkaar
à Single-strand DNA-binding eiwit ( SSB): enkelstrenig DNA stabiel houden
à ringvormig eiwit: helpt DNA-polymerase vast te houden op de DNA-streng