GENETICA EN EVOLUTIE
HOOFDSTUK 14
Het humane genoom project / genoom oorlog
SANGER DIDEOXYNUCLEOTIDE SEQUENCING
- Nucleotiden die dideoxyribose (bevat H-groep in plaats van OH-groep) bevatten worden
ddNTPs genoemd na het inbouwen van een ddNPT kan de DNA keten niet langer
verlengd worden en wordt het dus afgebroken
Voor sanger sequencing heb je nodig:
- Primer
- dNTP’s
- TAQ polymerase
- ddNTP – PCR stopt na het inbouwen van een DDNTP
Het karakteriseren van hele genomen is fundamenteel voor het begrijpen van de gehele hoeveelheid
genetische informatie die ten grondslag ligt aan de fysiologie, ontwikkeling en evolutie van levende
organismen, en voor de ontdekking van nieuwe genen, zoals genen die een rol spelen bij genetische
ziekten bij de mens
De manier waarop genoom-sequenties worden
verkregen:
1. de DNA-moleculen van een genoom worden
in duizend of miljoenen (meer of minder)
random, elkaar overlappende kleine
segmenten gebroken
2. de sequentie van ieder segment apart wordt
gelezen
3. de computer vind de overlap tussen de
kleine segmenten waar de sequenties
identiek zijn
4. verdergaan met het overlappen van steeds
grotere segmenten totdat alle kleine
segmenten zijn verbonden
,Individual sequencing reactions (sequencing reads) kunnen DNA-sequenties lezen die 100 tot 15.000
nucleotides lang zijn – héél klein vergeleken de lengte van het hele humane genoom (3 miljard
nucleotides)
Sequence assembly = het opbouwen van alle individuele reads in een consensus sequence – een
sequentie waarbij er een bepaalde consensus (overeenkomst) is dat het een authentieke
representatie van de sequentie van elk van de DNA-moleculen in het genoom is
In het algemeen wordt er een 30-fold average coverage gehanteerd
De doelen van het sequencen van een genoom:
- het maken van een consensus sequentie die een ware en accurate representatie is van
het genoom
geen enkel persoonlijk (enkel) genoom is representatief voor het ‘algemene’ genoom –
ieder organisme is uniek in zijn genoom
- de genoomsequentie dient als een standaard/referentie waarmee andere sequenties kan
worden vergeleken
De genoomsequentie kan variëren:
- draft quality – algemene schets, maar nog veel fouten
- finished quality – minder fouten
- complete quality – geen fouten
Whole-genome shotgun sequencing (WGS) – gebaseerd op het bepalen van de sequentie van vele
segmenten van genomisch DNA die zijn verkregen door de lange chromosomen van DNA in veel
korte segmenten te breken
Twee methodes van WES:
- “traditionele WGS sequencing” – klonen van DNA in microbiële cellen door gebruik te
maken van dideoxy-sequentietechniek
- “next-generation WGS-sequencing” – celvrije methoden die nieuwe technieken
gebruiken en die ontworpen zijn voor een zeer hoge doorvoer
TRADITIONELE WGS SEQUENCING
- Opbouw van de verzameling van de vele korte DNA segmenten
- Deze DNA segmenten worden in een aantal aanvullende typen chromosomen geplaatst
- De DNA segmenten worden gekopieerd in microben
Verkrijgen van een genomische bibliotheek – de vele korte DNA segmenten:
- Restrictie-enzymen – knippen de DNA streng op specifieke sequenties
- De resulterende fragmenten hebben aan beide uiteinden korte enkele DNA-strengen
- Ieder fragment wordt samengevoegd met een DNA-molecuul van het aanvullende
chromosoom (dit is ook geknipt en bevat een complementair uiteinde)
- Er worden meerdere kopieën van het genomische DNA in fragmenten gesneden
De uiteindelijk resulteerden ‘bibliotheek’ wordt shotgun-bibliotheek genoemd, omdat sequentie-
uitlezingen worden verkregen van willekeurig geselecteerde klonen uit de hele genoombibliotheek
zonder enige informatie over waar deze klonen in het genoom in kaart zijn gebracht
, De genoomfragmenten in klonen uit de shotgun-bibliotheek worden gedeeltelijk gesequenced – deze
sequentiereactie begint met een bekende primer
De output is een grote verzameling van willekeurige korte reeksen, waarvan sommige elkaar
overlappen dit wordt samengebracht tot het hele genoom door homologe sequenties te matchen
die worden gedeeld door uitlezingen van overlappende klonen
Sequentiecontigs = een set van overlappende DNA segmenten die samen een consensus-gebied van
DNA representeren
NEXT-GENERATION WGS SEQUENCING
Verschillen met traditionele WGS sequencing:
- DNA-moleculen worden voorbereid voor sequencen in cel-vrije reactions (geen klonen in
microben)
- Miljoenen individuele DNA fragmenten worden parallel geïsoleerd en gesequenced –
scheelt tijd
- Verbeterde technologie maakt het detecteren van de sequentie-producten makkelijker
ILLUMINA SEQUENCING – next-generation WGS sequencing
1. Maken van een DNA-sequentie bibliotheek – het geïsoleerde DNA wordt in kleine stukken
gebroken en er worden adapters toegevoegd
2. DNA-fragmenten binden zich aan een flow-cell – deze bevat sequenties die complementair
zijn aan beide adapters – de twee adapters binden een verschillende sequenties van
complementaire oligonucleotides; vorming van een brug-formatie
Hierna treedt er PCR bridge amplification op – er wordt een tweede, identieke streng aan de
streng gemaakt
HOOFDSTUK 14
Het humane genoom project / genoom oorlog
SANGER DIDEOXYNUCLEOTIDE SEQUENCING
- Nucleotiden die dideoxyribose (bevat H-groep in plaats van OH-groep) bevatten worden
ddNTPs genoemd na het inbouwen van een ddNPT kan de DNA keten niet langer
verlengd worden en wordt het dus afgebroken
Voor sanger sequencing heb je nodig:
- Primer
- dNTP’s
- TAQ polymerase
- ddNTP – PCR stopt na het inbouwen van een DDNTP
Het karakteriseren van hele genomen is fundamenteel voor het begrijpen van de gehele hoeveelheid
genetische informatie die ten grondslag ligt aan de fysiologie, ontwikkeling en evolutie van levende
organismen, en voor de ontdekking van nieuwe genen, zoals genen die een rol spelen bij genetische
ziekten bij de mens
De manier waarop genoom-sequenties worden
verkregen:
1. de DNA-moleculen van een genoom worden
in duizend of miljoenen (meer of minder)
random, elkaar overlappende kleine
segmenten gebroken
2. de sequentie van ieder segment apart wordt
gelezen
3. de computer vind de overlap tussen de
kleine segmenten waar de sequenties
identiek zijn
4. verdergaan met het overlappen van steeds
grotere segmenten totdat alle kleine
segmenten zijn verbonden
,Individual sequencing reactions (sequencing reads) kunnen DNA-sequenties lezen die 100 tot 15.000
nucleotides lang zijn – héél klein vergeleken de lengte van het hele humane genoom (3 miljard
nucleotides)
Sequence assembly = het opbouwen van alle individuele reads in een consensus sequence – een
sequentie waarbij er een bepaalde consensus (overeenkomst) is dat het een authentieke
representatie van de sequentie van elk van de DNA-moleculen in het genoom is
In het algemeen wordt er een 30-fold average coverage gehanteerd
De doelen van het sequencen van een genoom:
- het maken van een consensus sequentie die een ware en accurate representatie is van
het genoom
geen enkel persoonlijk (enkel) genoom is representatief voor het ‘algemene’ genoom –
ieder organisme is uniek in zijn genoom
- de genoomsequentie dient als een standaard/referentie waarmee andere sequenties kan
worden vergeleken
De genoomsequentie kan variëren:
- draft quality – algemene schets, maar nog veel fouten
- finished quality – minder fouten
- complete quality – geen fouten
Whole-genome shotgun sequencing (WGS) – gebaseerd op het bepalen van de sequentie van vele
segmenten van genomisch DNA die zijn verkregen door de lange chromosomen van DNA in veel
korte segmenten te breken
Twee methodes van WES:
- “traditionele WGS sequencing” – klonen van DNA in microbiële cellen door gebruik te
maken van dideoxy-sequentietechniek
- “next-generation WGS-sequencing” – celvrije methoden die nieuwe technieken
gebruiken en die ontworpen zijn voor een zeer hoge doorvoer
TRADITIONELE WGS SEQUENCING
- Opbouw van de verzameling van de vele korte DNA segmenten
- Deze DNA segmenten worden in een aantal aanvullende typen chromosomen geplaatst
- De DNA segmenten worden gekopieerd in microben
Verkrijgen van een genomische bibliotheek – de vele korte DNA segmenten:
- Restrictie-enzymen – knippen de DNA streng op specifieke sequenties
- De resulterende fragmenten hebben aan beide uiteinden korte enkele DNA-strengen
- Ieder fragment wordt samengevoegd met een DNA-molecuul van het aanvullende
chromosoom (dit is ook geknipt en bevat een complementair uiteinde)
- Er worden meerdere kopieën van het genomische DNA in fragmenten gesneden
De uiteindelijk resulteerden ‘bibliotheek’ wordt shotgun-bibliotheek genoemd, omdat sequentie-
uitlezingen worden verkregen van willekeurig geselecteerde klonen uit de hele genoombibliotheek
zonder enige informatie over waar deze klonen in het genoom in kaart zijn gebracht
, De genoomfragmenten in klonen uit de shotgun-bibliotheek worden gedeeltelijk gesequenced – deze
sequentiereactie begint met een bekende primer
De output is een grote verzameling van willekeurige korte reeksen, waarvan sommige elkaar
overlappen dit wordt samengebracht tot het hele genoom door homologe sequenties te matchen
die worden gedeeld door uitlezingen van overlappende klonen
Sequentiecontigs = een set van overlappende DNA segmenten die samen een consensus-gebied van
DNA representeren
NEXT-GENERATION WGS SEQUENCING
Verschillen met traditionele WGS sequencing:
- DNA-moleculen worden voorbereid voor sequencen in cel-vrije reactions (geen klonen in
microben)
- Miljoenen individuele DNA fragmenten worden parallel geïsoleerd en gesequenced –
scheelt tijd
- Verbeterde technologie maakt het detecteren van de sequentie-producten makkelijker
ILLUMINA SEQUENCING – next-generation WGS sequencing
1. Maken van een DNA-sequentie bibliotheek – het geïsoleerde DNA wordt in kleine stukken
gebroken en er worden adapters toegevoegd
2. DNA-fragmenten binden zich aan een flow-cell – deze bevat sequenties die complementair
zijn aan beide adapters – de twee adapters binden een verschillende sequenties van
complementaire oligonucleotides; vorming van een brug-formatie
Hierna treedt er PCR bridge amplification op – er wordt een tweede, identieke streng aan de
streng gemaakt
