Bacteriologie
Practicumnota’s
Praktijkopdrachten
1
,Practicum 1: Basistechnieken
1. Het maken van een vijfhoek
1.1 Doel
Vaardigheden oefenen.
1.2 Materiaal
• 3 TSA-platen
• Bacteriesuspensie S. epidermidis (Se)
• Entoog
1.3 Methode
• Beënt één TSA-plaat met bacteriesuspensie Se (m.b.v. entoog of een druppeltje van een
pasteurpipet) en plaats uit volgens de methode van de vijfhoek.
• Incubeer de plaat overnacht bij 37°C.
• Evalueer of je vijfhoek gelukt is, m.a.w. of de bacteriën voldoende verdund zijn om bij de laatste
zijde van de vijfhoek afzonderlijke kolonies waar te nemen.
1.4 Resultaten
Vraag 1: Wat kan je doen als je geen individuele kolonies waarneemt?
• Minder inoculum gebruiken
• Meer verdunnen
• Correct flamberen en afkoelen
Vraag 2: Wat kan je doen als meerdere zijden van de vijfhoek geen groei tonen?
• Meer geconcentreerde suspensie gebruiken
• Vermijd te veel flamberen (bacteriën kunnen afsterven door hitte)
1.5 Conclusie:
Na incubatie waren er afzonderlijke kolonies beschikbaar in de laatste zone van de vijfhoek, wat
aangeeft dat de methode goed werd uitgevoerd.
1.6 Reflectie
Voor een nog beter resultaat kan je:
• Iets meer overlapping voorzien tussen de zones om meer kolonies tegen het einde te krijgen.
• Minder in de agar prikken en zachter strijken om schade aan de agar te verminderen.
2. Concentratiebepaling
2
,2.1 Doel
Het doel is om de eenheid CFU/mL (Colony Forming Units per milliliter) te definiëren, de voor- en
nadelen van deze methode toe te lichten, en een overzicht te geven van de verschillende technieken
die gebruikt worden om CFU/mL te bepalen, zoals:
• Plaatuitplating
• Membraanfiltratie
• Seriële verdunningen
2.2 Theoretische oefening
Gegeven:
• Verdunningsreeks: 1/10
• Uitgeplaat volume: 172 µL = 0,172 mL
• Telbare verdunningen:
o 10⁻³ → 4 kolonies
o 10⁻² → 36 kolonies
Berekening CFU/mL: Formule:
𝐴𝑎𝑛𝑡𝑎𝑙 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑠
𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 = × 𝑉𝑒𝑟𝑑𝑢𝑛𝑛𝑖𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
𝐺𝑒ë𝑛𝑡 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 (𝑚𝐿)
• Voor 10⁻³ (4 kolonies):
4
𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 = × 103 ≈ 23,26 × 103 = 2,33 × 104
0,172
• Voor 10⁻² (36 kolonies):
36
𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 = × 102 ≈ 209,3 × 102 = 2,09 × 104
0,172
Gemiddelde CFU/mL:
(2,33 × 104 ) + (2,09 × 104 )
≈ 2,21 × 104 CFU/mL
2
Wat is de concentratie in mijn staal?
De berekende concentratie in het staal is ongeveer 2,21 × 10⁴ CFU/mL (gemiddelde van beide
verdunningen).
Met welke verdunningen houd ik rekening? Waarom?
• 10⁻² (36 kolonies)
• Deze verdunning levert telbare platen (tussen 20 en 200 kolonies is ideaal.
• Verdunningen met te weinig kolonies (<20) of te veel (>200) worden niet gebruikt.
Vraag
3
, Is Staphylococcus epidermidis Gram-positief of Gram-negatief? Behoort deze kiem tot de residente of
transiënte flora van de huid? Noteer je bron!
Antwoord
Staphylococcus epidermidis is Gram-positief (coccen in trosjes).
Deze bacterie behoort tot de residente huidflora.
Het is een commensaal micro-organisme dat normaal op de huid voorkomt en meestal onschadelijk
is, maar opportunistisch pathogeen kan worden bij implantaten of katheters.
• Bron:
Tortora, Funke & Case – Microbiology: An Introduction (laatste editie)
LCI Richtlijn: Staphylococcus epidermidis – huidflora
2.3 Materiaal
• Bacteriesuspensie S. epidermidis (Se) met onbekende CFU-waarde
• 3 TSA-platen
• Steriele fysiologische buffer (PBS)
• 8 lege, steriele plastieken verdunningsbuisjes
2.4 Methode
1. Maak een 1/10 verdunningsreeks van de bacteriesuspensie (van 10⁻¹ tot 10⁻⁸) in steriele
fysiologische buffer. Het eindvolume van elke verdunning is 0,9 mL (uitgezonderd laatste
buisje).
2. Van de verdunningen 10⁻³ tot en met 10⁻⁸ wordt 0,1 mL homogeen op een halve TSA-agarplaat
uitgeplaatst.
3. Incubeer bij 37°C gedurende 24 uur.
4. Tel na incubatie (de volgende practicumdag) het aantal kolonies (CFU) op de agarplaten en
noteer.
Buis Verdunning Buffer (mL) Toevoegen (mL) Eindvolume (mL)
1 10⁻¹ 0,9 0,1 stock 0,9
2 10⁻² 0,9 0,1 uit buis 1 0,9
3 10⁻³ 0,9 0,1 uit buis 2 0,9
4 10⁻⁴ 0,9 0,1 uit buis 3 0,9
5 10⁻⁵ 0,9 0,1 uit buis 4 0,9
6 10⁻⁶ 0,9 0,1 uit buis 5 0,9
7 10⁻⁷ 0,9 0,1 uit buis 6 0,9
8 10⁻⁸ 0,9 0,1 uit buis 7 1,0
4
Practicumnota’s
Praktijkopdrachten
1
,Practicum 1: Basistechnieken
1. Het maken van een vijfhoek
1.1 Doel
Vaardigheden oefenen.
1.2 Materiaal
• 3 TSA-platen
• Bacteriesuspensie S. epidermidis (Se)
• Entoog
1.3 Methode
• Beënt één TSA-plaat met bacteriesuspensie Se (m.b.v. entoog of een druppeltje van een
pasteurpipet) en plaats uit volgens de methode van de vijfhoek.
• Incubeer de plaat overnacht bij 37°C.
• Evalueer of je vijfhoek gelukt is, m.a.w. of de bacteriën voldoende verdund zijn om bij de laatste
zijde van de vijfhoek afzonderlijke kolonies waar te nemen.
1.4 Resultaten
Vraag 1: Wat kan je doen als je geen individuele kolonies waarneemt?
• Minder inoculum gebruiken
• Meer verdunnen
• Correct flamberen en afkoelen
Vraag 2: Wat kan je doen als meerdere zijden van de vijfhoek geen groei tonen?
• Meer geconcentreerde suspensie gebruiken
• Vermijd te veel flamberen (bacteriën kunnen afsterven door hitte)
1.5 Conclusie:
Na incubatie waren er afzonderlijke kolonies beschikbaar in de laatste zone van de vijfhoek, wat
aangeeft dat de methode goed werd uitgevoerd.
1.6 Reflectie
Voor een nog beter resultaat kan je:
• Iets meer overlapping voorzien tussen de zones om meer kolonies tegen het einde te krijgen.
• Minder in de agar prikken en zachter strijken om schade aan de agar te verminderen.
2. Concentratiebepaling
2
,2.1 Doel
Het doel is om de eenheid CFU/mL (Colony Forming Units per milliliter) te definiëren, de voor- en
nadelen van deze methode toe te lichten, en een overzicht te geven van de verschillende technieken
die gebruikt worden om CFU/mL te bepalen, zoals:
• Plaatuitplating
• Membraanfiltratie
• Seriële verdunningen
2.2 Theoretische oefening
Gegeven:
• Verdunningsreeks: 1/10
• Uitgeplaat volume: 172 µL = 0,172 mL
• Telbare verdunningen:
o 10⁻³ → 4 kolonies
o 10⁻² → 36 kolonies
Berekening CFU/mL: Formule:
𝐴𝑎𝑛𝑡𝑎𝑙 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑠
𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 = × 𝑉𝑒𝑟𝑑𝑢𝑛𝑛𝑖𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
𝐺𝑒ë𝑛𝑡 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 (𝑚𝐿)
• Voor 10⁻³ (4 kolonies):
4
𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 = × 103 ≈ 23,26 × 103 = 2,33 × 104
0,172
• Voor 10⁻² (36 kolonies):
36
𝐶𝐹𝑈/𝑚𝐿 = × 102 ≈ 209,3 × 102 = 2,09 × 104
0,172
Gemiddelde CFU/mL:
(2,33 × 104 ) + (2,09 × 104 )
≈ 2,21 × 104 CFU/mL
2
Wat is de concentratie in mijn staal?
De berekende concentratie in het staal is ongeveer 2,21 × 10⁴ CFU/mL (gemiddelde van beide
verdunningen).
Met welke verdunningen houd ik rekening? Waarom?
• 10⁻² (36 kolonies)
• Deze verdunning levert telbare platen (tussen 20 en 200 kolonies is ideaal.
• Verdunningen met te weinig kolonies (<20) of te veel (>200) worden niet gebruikt.
Vraag
3
, Is Staphylococcus epidermidis Gram-positief of Gram-negatief? Behoort deze kiem tot de residente of
transiënte flora van de huid? Noteer je bron!
Antwoord
Staphylococcus epidermidis is Gram-positief (coccen in trosjes).
Deze bacterie behoort tot de residente huidflora.
Het is een commensaal micro-organisme dat normaal op de huid voorkomt en meestal onschadelijk
is, maar opportunistisch pathogeen kan worden bij implantaten of katheters.
• Bron:
Tortora, Funke & Case – Microbiology: An Introduction (laatste editie)
LCI Richtlijn: Staphylococcus epidermidis – huidflora
2.3 Materiaal
• Bacteriesuspensie S. epidermidis (Se) met onbekende CFU-waarde
• 3 TSA-platen
• Steriele fysiologische buffer (PBS)
• 8 lege, steriele plastieken verdunningsbuisjes
2.4 Methode
1. Maak een 1/10 verdunningsreeks van de bacteriesuspensie (van 10⁻¹ tot 10⁻⁸) in steriele
fysiologische buffer. Het eindvolume van elke verdunning is 0,9 mL (uitgezonderd laatste
buisje).
2. Van de verdunningen 10⁻³ tot en met 10⁻⁸ wordt 0,1 mL homogeen op een halve TSA-agarplaat
uitgeplaatst.
3. Incubeer bij 37°C gedurende 24 uur.
4. Tel na incubatie (de volgende practicumdag) het aantal kolonies (CFU) op de agarplaten en
noteer.
Buis Verdunning Buffer (mL) Toevoegen (mL) Eindvolume (mL)
1 10⁻¹ 0,9 0,1 stock 0,9
2 10⁻² 0,9 0,1 uit buis 1 0,9
3 10⁻³ 0,9 0,1 uit buis 2 0,9
4 10⁻⁴ 0,9 0,1 uit buis 3 0,9
5 10⁻⁵ 0,9 0,1 uit buis 4 0,9
6 10⁻⁶ 0,9 0,1 uit buis 5 0,9
7 10⁻⁷ 0,9 0,1 uit buis 6 0,9
8 10⁻⁸ 0,9 0,1 uit buis 7 1,0
4
