Hoorcollege 4
Lentiviral vector inegrates randomly
• Integreert in actieve genen
• Random integratie, geen selectie
o Ook na 18 maanden
• Heeft geen LMO2 effect, dus ook geen leukemie
• Geen bekende integratie sites in genen die belangrijk zijn voor clonal expansion
o Meer integraties in verschillende genen (125 verschillende)
Genetherapie voor MLD
• Verstoring van functie van witte bloedcellen
• Lysosomale storage ziekte
• Mutaties in het ARSA-gen
o ARSA ® arylsulfatase A
o Accumulatie van sulfatide in:
§ CNS ® oligodendrocyten, microglia en neuronen
§ PNS ® Schwann cellen, macrofagen
o Demyelinatie ® neuron sterft af
• Zorgt voor motorische en cognitieve beperkingen
• Geeft schade aan de hersenen, te visualiseren met MRI-scan
o Witte stof verdwijnt, grijze stof wordt ook aangedaan
o Bij behandeling met gentherapie leidt tot een verbetering van de hersenstructuur
• Sulfatide is belangrijk voor de vorming van galactocerebroside
o Dit is weer belangrijk voor de vorming van ceramide
Gentherapie voor ALD
• Defect in het ALD-eiwit
o ATP-binding cassette transporter
o ABCD1-gen
o Peroxisomaaleiwit
o Lipide afbraak in oligodendrocyten en microglia
o Voornamelijk schade in de hersenen en de bijnieren
• Zorgt voor demyelinatie
• Twee jongens behandeld met lentivirus in stamcellen
• Eiwitten kunnen via het bloed ook in de hersenen komen, en dus kan je met gentherapie ook
andere ziekten dan die van het bloed behandelen
Verbeterde versie van virale vector met retrovirus
• Self-inactivating enhancer (SIN)
o Deletie in de U3 enhancer van de
LTR
o Promotor van elongation factor
(EFS)
o Geen intron
Voor gentherapie worden altijd hematopoetische stamcellen gebruikt.
, RNA-interferentie
RNAi
• RNA-interferentie
• Sequentie specifiek
• Zorgt voor afbraak van mRNA
o Cellulair mRNA
o Viraal RNA
• Afweermechanisme van de cel
o Beschermt tegen virussen
o Controle van genexpressie
siRNA pathway
• Komt in de cel via een virus of artificieel
• Dicer ® dsRNAse
o Knipt dsRNA dat via virale infectie
in de cel is gekomen of in de cel is
getransformeerd
o Knipt het dsRNA in stukje van 21-
25 nucleotiden lang
• RISC ® herkent de stukjes dsRNA
o RNA-induced silencing complex
o Bevat argonaut
• Ago ® argonaut
o Catalytische subunit van RISC
o Knipt mRNA
o siRNA in RISC bindt aan het bijbehorende bijbehorende mRNA en zo kan ago het
mRNA knippen
miRNA pathway ® natuurlijk voorkomende RNAs die gecodeerd zijn in ons genoom (ipv eiwit
coderen ze voor RNAs)
• Drosha ® dsRNAse
o Knipt dsmiRNA dat gemaakt is in de celkern
• Dicer knipt weer het dsmiRNA
• RISC herkent de stukjes miRNA en Ago knipt het
• De efficiëntie van binding van RISC aan het mRNA bepaalt of het geknipt wordt of dat RISC
alleen in de weg zit van het ribosoom
o Sterke binding ® mRNA geknipt
o Zwakkere binding ® translatie wordt onderbroken
Kan RNA-interferentie een therapie zijn?
• dsRNAs groter dan 60 nucleotiden zorgen voor een IFN-respons
o Dit leidt toot activatie van RNAseL ® breekt RNA af
o Zorgt voor inductie van PKR
§ Protein kinase RNA-regulated
§ Target eIF2
o Zorgt voor een stop van de eiwitsynthese
§ Non-specifieke gen silencing
• IFN-respons beschermt ons tegen virale infecties
• Als het dsRNA kleiner is dan 60 nucleotiden paren of niet 100% homoloog is dan wordt RNAi
geactiveerd
o Hier wordt maar 1 soort mRNA gesilenced
Lentiviral vector inegrates randomly
• Integreert in actieve genen
• Random integratie, geen selectie
o Ook na 18 maanden
• Heeft geen LMO2 effect, dus ook geen leukemie
• Geen bekende integratie sites in genen die belangrijk zijn voor clonal expansion
o Meer integraties in verschillende genen (125 verschillende)
Genetherapie voor MLD
• Verstoring van functie van witte bloedcellen
• Lysosomale storage ziekte
• Mutaties in het ARSA-gen
o ARSA ® arylsulfatase A
o Accumulatie van sulfatide in:
§ CNS ® oligodendrocyten, microglia en neuronen
§ PNS ® Schwann cellen, macrofagen
o Demyelinatie ® neuron sterft af
• Zorgt voor motorische en cognitieve beperkingen
• Geeft schade aan de hersenen, te visualiseren met MRI-scan
o Witte stof verdwijnt, grijze stof wordt ook aangedaan
o Bij behandeling met gentherapie leidt tot een verbetering van de hersenstructuur
• Sulfatide is belangrijk voor de vorming van galactocerebroside
o Dit is weer belangrijk voor de vorming van ceramide
Gentherapie voor ALD
• Defect in het ALD-eiwit
o ATP-binding cassette transporter
o ABCD1-gen
o Peroxisomaaleiwit
o Lipide afbraak in oligodendrocyten en microglia
o Voornamelijk schade in de hersenen en de bijnieren
• Zorgt voor demyelinatie
• Twee jongens behandeld met lentivirus in stamcellen
• Eiwitten kunnen via het bloed ook in de hersenen komen, en dus kan je met gentherapie ook
andere ziekten dan die van het bloed behandelen
Verbeterde versie van virale vector met retrovirus
• Self-inactivating enhancer (SIN)
o Deletie in de U3 enhancer van de
LTR
o Promotor van elongation factor
(EFS)
o Geen intron
Voor gentherapie worden altijd hematopoetische stamcellen gebruikt.
, RNA-interferentie
RNAi
• RNA-interferentie
• Sequentie specifiek
• Zorgt voor afbraak van mRNA
o Cellulair mRNA
o Viraal RNA
• Afweermechanisme van de cel
o Beschermt tegen virussen
o Controle van genexpressie
siRNA pathway
• Komt in de cel via een virus of artificieel
• Dicer ® dsRNAse
o Knipt dsRNA dat via virale infectie
in de cel is gekomen of in de cel is
getransformeerd
o Knipt het dsRNA in stukje van 21-
25 nucleotiden lang
• RISC ® herkent de stukjes dsRNA
o RNA-induced silencing complex
o Bevat argonaut
• Ago ® argonaut
o Catalytische subunit van RISC
o Knipt mRNA
o siRNA in RISC bindt aan het bijbehorende bijbehorende mRNA en zo kan ago het
mRNA knippen
miRNA pathway ® natuurlijk voorkomende RNAs die gecodeerd zijn in ons genoom (ipv eiwit
coderen ze voor RNAs)
• Drosha ® dsRNAse
o Knipt dsmiRNA dat gemaakt is in de celkern
• Dicer knipt weer het dsmiRNA
• RISC herkent de stukjes miRNA en Ago knipt het
• De efficiëntie van binding van RISC aan het mRNA bepaalt of het geknipt wordt of dat RISC
alleen in de weg zit van het ribosoom
o Sterke binding ® mRNA geknipt
o Zwakkere binding ® translatie wordt onderbroken
Kan RNA-interferentie een therapie zijn?
• dsRNAs groter dan 60 nucleotiden zorgen voor een IFN-respons
o Dit leidt toot activatie van RNAseL ® breekt RNA af
o Zorgt voor inductie van PKR
§ Protein kinase RNA-regulated
§ Target eIF2
o Zorgt voor een stop van de eiwitsynthese
§ Non-specifieke gen silencing
• IFN-respons beschermt ons tegen virale infecties
• Als het dsRNA kleiner is dan 60 nucleotiden paren of niet 100% homoloog is dan wordt RNAi
geactiveerd
o Hier wordt maar 1 soort mRNA gesilenced
