Samenvatting Moleculaire biologie theorie (MBT)

MBT samenvatting
Hoorcollege 2 =>
 Wat doet een PCR ?
Vermeerderd (amplificeert) een specifiek stuk DNA.

 Waarom doe je een PCR ?
- Aanwezigheid van een gen of andere sequentie aantonen. ( bijv. identificatie van personen
en forensisch onderzoek )
Forensisch PCR : hoeveelheid repeats aantonen in variabele DNA regio’s -> per persoon verschillend.
- Promotor, gen of andere genetische onderdelen te kloneren. ( bijv. fundamenteel onderzoek
naar functie van DNA sequenties)

PCR + input DNA -> Agarose gel electrophoresis -> UV visualisation -> The final product

 Waarop is de PCR techniek gebaseerd ?
DNA replicatie in de cel ( in vivo)
- Enkelstrengs DNA maken = helicase
- DNA polymerase bindt door primase en repliceert het DNA.
- DNA polymerase beweegt over het DNA van 3’naar 5, maar maakt nieuw DNA van 5’naar 3’.

 Waarmee maak je een PCR reactie specifiek ?
Door de primers die op specifieke locaties binden.



96 graden
 Kan tegen hoge
temperaturen

 Wat heb je nodig bij PCR ?
- PCR machine (thermal cycler)
- PCR reactievaatjes
- PCR reactiemengsel : DNA (template),
twee primers, nucleotiden, Taq
polymerase en buffer.
- Analyse systeem : bijv. agarose gel

 Drie stappen PCR :
= Enkelstrengs DNA maken. (96 graden)
= Plakken primers ( 50-65 graden)

= Verlengen primers ( 72 graden)
Elke cyclus verdubbelt het PCR product.
Vaak 30-40 keer herhalen.
Bij stap 0 extra denatureren = voor genomische DNA.



 Ontwerpen van primers
- Korte stukjes enkelstrengs DNA (17-28 nt)

, - Andere naam : ‘Oligo’
- Synthetisch te maken, opgebouwd uit G,A,T en C
- Elke sequentie te maken
- Specifiek

De kans dat 1 base specifiek kan binden = ¼ , er zijn namelijk 4 nucleotiden.
- Dus wanneer je een primer hebt van 4 nucleotiden is de kans ( ¼ ) 4 dat het specifiek kan
binden. Om de 256 basen kan de primer binden.
Een primer is 20 nucleotiden lang, omdat deze primer statistisch minder dan 1 keer ergens in het
humane genoom kan binden. ( Humaan genoom = 3*10 9 )




 Algemene regels voor primer design
- 3’-end G of C -> Deze nucleotiden zijn sterker, omdat ze 3 waterstofbindingen bevatten.
- 17-28 bp
- 40-60 % GC -> zorgt voor een goede annealing temperatuur.
- Voorkom primer dimeren -> samengevoegde forward en reverse primer.
- Voorkom interne “self-annealing”
- Tm (smelttemperatuur) tussen 55 en 70 graden -> waterstofbindingen verbreken, 50 % van je
primers bindt nog. ( primers van DNA afsmelten)

 Berekening smelttemperatuur ( Tm )
Voor 15-25 basen
Tm = 2 (A + T) + 4 (C + G) Grove schatting!
Tm 50 % is gebonden (ds) 50 % los (ss)
Je wilt dat alle primers gebonden zitten = annealing temperatuur (Ta)
Dus Ta = Tm – 5 graden
 Voor een PCR heb je 2 primers nodig. Reken van beide de Ta uit en de laagste Ta is de
temperatuur die je in de PCR reactie gebruikt. Beide primers moeten kunnen binden.

Te lage annealing temperatuur zorgt voor foutbindingen doordat de primers niet afsmelten, hierdoor
ontstaan meerdere aspecifieke producten.

 Extensie = bij elk PCR protocol is de tijd anders, dit omdat het afhangt van de grote van het
product.
Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) :
- 72 graden optimale synthese temperatuur
- Hittestabiel
- Geen proofreading activiteit
- 1 kb/ min

Proofreading verwijdert fouten basen die ingebouwd zijn door middel van exonuclease activiteit (3’->
5’) worden ze verwijdert door de polymerases zelf.
- Niet alle polymerases hebben dat. (Zoals Taq)
- Polymerases zijn door proofreading langzamer, maar maken veel minder fouten.

,  Template DNA
- Meestal wordt DNA gezuiverd ( je weet dan de zuiverheid en de hoeveelheid)
- Geen remmers van DNA polymerase ( bijv. Heem groep)
- Target bereikbaar voor primers en Taq
- Geen EDTA ( of een hele lage concentratie hiervan) : Mg 2+
- Niet teveel fragmentatie/afbraak
- Niet te vaak vriezen/ontdooien

Factoren die degradatie van DNA bevorderen : Te veel degradatie = geen PCR mogelijk
Tijd, temperatuur, vochtigheid, licht (UV) en blootstelling aan chemicaliën.




Hoorcollege 3 =>
Kloneren van DNA = knippen en plakken
 Waarom kloneren ?
Manipuleren van DNA om :
- Eiwit in grote hoeveelheden te produceren.
- Functie van genen of domeinen van genen te onderzoeken.
- Effect van gen mutanten bestuderen.
- Wanneer is een promotor actief?
- Eiwit fluorescent maken en lokalisatie volgen.

 5 stappen van kloneren :
1. Digestie : DNA ( plasmide of een PCR product) met restrictie-enzym(en) knippen.
2. Ligatie : DNA fragment in het plasmide inbouwen
3. Transformatie : de plasmiden worden opgenomen door de bactieriën.
4. Identificatie van de juiste bacterie met het juiste fragment
- Sommige bacteriën nemen niets op, en sommige bacteriën nemen een verkeerd (leeg)
plasmide op.
5. Vermenigvuldigen : opkweken van de juiste bacterie.

 Gebruik RE om DNA te knippen en om plasmide te lineariseren.
Restrictie enzymen :
- Enzymen die DNA aan specifieke sequenties binden en de suiker-fosfaatketen verbreken
(endo-nuclease).
- Oorspronkelijk betrokken in bacteriën en archaea bij afbraak van viraal DNA.
- Vele geïdentificeerd.
- Vele zijn commercieel verkrijgbaar.

Type II RE : herkennen palindroom (reverse complementair), en knippen in een 4-8 bp grote
palindroom sequentie.
- Type II endonucleases zijn homodimeren.
- Type II RE geven sticky-ends (stukje
enkelstrengs DNA) of blunt ends.

5’overhang -> eindigt met 5’ en andersom.